酵母菌转化香叶醇和橙花醇的机制研究

摘要

微生物生长引起食品变质事关国民生命安全和健康的大事。鉴于化学防腐剂使用条件局限性、长期使用会产生生物抗药性和累积性毒害等问题，凶此，在战略上采用先合成目标产物的前体，然后用微生物转化，这对人类减少对自然界依赖，缓解生态平衡压力，具有重要意义。本项研究采用野生型酵母菌经紫外线诱变筛选产生较高活性的目标酵母菌，将人工合成构成柠檬醛的两个顺反异构物的前体（即香叶醇和橙花醇）转化成具有抗菌性的醛、并初步总结出转化的机制和条件，阐明其抑制黑曲霉的过程及机理。
　　 1．筛选出高效转化目标产物的菌株：分离野生型酵母菌作为出发菌株，经紫外线诱变后筛选出目标菌株，其后对目标产物转化率比对照组高3.06倍的目标菌株，经转接25代后测定目标菌株具有很好的遗传稳定性，目标菌株与出发菌株的生长曲线和对糖的利用情况虽基本接近（生长速率分别是0.359和0.321），但对糖的优先利用情况均是：麦芽糖＞蔗糖＞D-半乳糖＞木糖。
　　 2．筛选实用的转化促进剂：香叶醇和橙花醇均无抗菌性，因此能进行酵母菌的转化，在转化的条件选择上，以在液体培养基中添加NAD+，同时加入相应的醇接种密封于28℃、100r/min摇床培养48h，其转化产物具有很好的抗菌性，而其他方法均无抗菌性，高效液相色谱显示该方法的产物中有香叶醛或橙花醛的吸收峰。
　　 3．目标产物抗菌效果监测：转化后的香叶醇和橙花醇中含有抗菌性的醛，由于醇无抗菌性，因此抗菌的主要物质是转化后的醛，无论是液体方法还是气体方法橙花醇转化后的抗菌性强于香叶醇转化后的产物，而将两组以1:1的比例混合后因醇的加入而导致抗菌性减弱；液体混入与气体扩散抗菌方法相比后者效果优于前者。
　　 4．气体扩散抗菌的方法证实转化的目标产物与柠檬醛作用类似：转化后的醛与柠檬醛一样能抑制细胞的氧化还原酶类，但程度有所差别，对于MDH酶来说，以NADP+为辅酶时柠檬醛对照组比空白对照组降低了45.7％；橙花醛组比空白对照组降低了27.6％；香叶醛组比空白对照组降低了9.7％；以NAD+为辅酶时柠檬醛对照组比对照组降低了46.7％；橙花醛组比空白对照组降低了33.3％；香叶醛组比空白对照组降低了14.8％。
　　 目标产物组SDH平均比活介于空白对照组与相柠檬醛对照组之间，柠檬醛对照组SDH平均比活比空白对照组降低了55.99％;橙花醛组SDH的平均比活比空白对照组降低了35.63％；香叶醛组SDll的平均比活比空白对照组降低了16.18％。
　　 5．转化后的目标产物具有与天然产物相同的抑菌机制：①以琥珀酸为底物时橙花醛组和香叶醛组线粒体呼吸速率分别为4.93％和5.58％；比空白对照组降低了29.67％和20.39％，而比柠檬醛对照组都提高了18.66％和28.14％。②以a酮戊二酸为底物时橙花醛组和香叶醛组线粒体呼吸速率分别为4.81％和5.47％；比对照组降低了30.29％和20.72％，与柠檬醛组相比提高了17.67％和27.61％。③以丙酮酸为底物时橙花醛组和香叶醛组线粒体呼吸速率分别为5.00％和5.86％；分别比对照组降低了30.94％和19.06％，与柠檬醛组相比分别提高了17.40％和29.52％。而橙花醛组和香叶醛组Mt的呼吸速率是介于对照组和柠檬醛组之间的，
　　 综上所述，利用酵母菌的乙醇脱氢酶，以完整酵母菌活细胞，在添加NAD+的条件下，能将香叶醇和橙花醇转化成香叶醛和橙花醛，具有显著的抗菌性，其抗菌机理与天然柠檬醛类似。