微生物基因组与元基因组方法研究与应用

摘要

微生物广泛分布于自然界中，它们种类多、数量大，有着复杂的相互作用，对许多生物过程产生影响，因此了解微生物有助于理解自然界。在微生物的研究中，微生物基因组和微生物元基因组有着重要的研究和应用前景。微生物基因组是研究微生物全部遗传物质的学科，针对微生物基因组的研究能帮助解释许多表型和遗传物质的关联，为解析更为复杂的相互作用打下基础，例如毒力和基因的关联。而微生物元基因组的研究能够解析自然界中微生物群落中，各微生物的种类，数量比例，和相互作用关系。因此，希望对微生物基因组和微生物元基因组的方法学及应用进行研究。 在方法学方面，分析了已有的微生物基因组分析方法和研究工具，然后借鉴已有的工具和方法结合自己编写的程序工具，整合了一套微生物基因组自动分析流程，包含测序数据下机的质量控制、基因组从头拼接，基因组注释，核心基因组和泛基因组筛选、毒力基因和耐药基因筛选、基因变异位点提取、基因序列比对和进化分析。同时，整合了一套通用微生物元基因组分析流程，包括测序数据下机质量控制、16s序列拼接、细菌物种鉴定和计数、常规数据分析。在应用方面，分析了食源性微生物单增李斯特菌的基因组，疫源性昆虫肠道微生物元基因组，辟谷人群肠道元基因组。对于食源性单增李斯特菌，其最关键的表型是毒力，因此对其9个重要毒力基因多样性进行了分析。发现单增李斯特菌重要毒力调控元件相对变异较少，变异模式较简单。不同世系(lineage)单增李斯特菌的毒力变异位点差异相对较大，而同一世系内的差异和单增的多位点序列分型(MLST)有部分关联。同时在某些毒力因子上发现了一些新的变异位点。 接着，研究了疫源性昆虫的肠道元基因组，希望了解这些昆虫肠道微生物，并通过这些微生物追踪检疫昆虫的地理来源。采集了全国多地多种具代表性的检疫性昆虫，通过实验和初步分析获得了他们肠道微生物组成。进一步分析发现，这些微生物中有三个占据主导的门(Phylum)，分别是厚壁菌门，变形菌门，拟杆菌门，且这三者的整体比例趋势为拟杆菌门大于厚壁菌门大于变形菌门。除苹果绵蚜肠道微生物α多样性较高外，其他昆虫间无显著差异。昆虫的肠 道微生物环境复杂，昆虫物种、食性、性别、发育状态都对这些微生物产生影响，因此无法通过常规的无监督分类方法如主成分分析来解析，但是可以通过有监督的如线性判别分析来解析。线性判别方法能够在微生物科(class)和目(order)水平，对昆虫群体进行地理溯源，同时能够在门(phylum)水平对昆虫个体进行地理溯源。 此外，分析了辟谷人群的肠道元基因组，希望了解长时间禁食对人体肠道微生物带来的影响。在辟谷前(day0)，辟谷中（day1-21），辟谷恢复期(day22-31)，正常期(day31-51)四个时期采集粪便样本。研究发现整个过程中，肠道微生物有明显变化。在辟谷中，变形菌门显著增加，随着辟谷结束和恢复，变形菌门逐渐下降，但直到正常期变形菌门依然比辟谷前高。拟杆菌门在辟谷期和恢复期明显下降，而到了正常期则明显恢复。厚壁菌门在辟谷期明显下降，而后逐渐恢复。 综上所述，整合建立了了微生物基因组与元基因组的自动化分析流程。并以此分析了食源性致病菌的毒力因子多态性、疫源性昆虫肠道菌群和禁食人群肠道。