PotD、TidD蛋白及谷氨酰胺合成酶的差异表达对大肠杆菌BL21(DE3)及恶臭假单胞菌F1生物膜生成的影响

摘要

生物膜(biofilms)是细菌吸附在有机或无机介质上时，通过分泌含表面多糖、蛋白、DNA的细胞外基质，将菌群包围其中所形成的复合体。在自然界中，细菌主要以生物膜形态存在。生物膜结构为内部菌群提供了物理性防护，生物膜中的菌体可形成互养共栖关系协同进行新陈代谢，遗传物质可横向转移使得进化更快，生物膜的形成对微生物提供了生态学优势。
　　 生物膜的形成受多种因素影响，外界环境条件如水文条件、吸附介质、营养物质、光照、温度等，细菌内在的调节机制如密度感应系统。细菌形成生物膜时，与浮游态相比多种基因差异表达，差异表达的基因包括细菌吸附过程、密度感应系统、代谢、应答环境压力、分子伴侣相关的基因。营养物质对生物膜形成的影响主要体现在影响细菌的生长速率。生长速率可影响细菌多种特性，如代谢活性、耐药性，吸附性和细胞外基质的合成。环境温度、pH对生物膜形成的影响与营养物质相似，适宜的温度、pH可加快生物膜细菌生长，提高吸附性。流体剪切力对生物膜结构的稳定有很大作用，高剪切力使生物膜更加致密，生物膜呈纤维细丝状，而在层流状态下呈单层细胞结构。剪切力可影响物质转运和胞外多糖的产生。
　　 在前期实验中利用蛋白组学研究方法，通过比较PseudomonasputidaF1蛋白表达的双向凝胶电泳(2-DGE)图谱，在不同碳源条件下生长的细胞中差异表达的蛋白质经胰酶消化以及基质辅助激光解吸电离飞行时间(Matrixassistedlaserdesorption/ionization-Timeofflight(MALDI-TOF)massspectrometry)质谱分析，结果表明，尽管该细菌在降解甲苯和乙苯时利用同一个代谢途径，代谢相关蛋白在微生物利用不同碳源时的表达量有所变化。差异表达蛋白可分为4类，代谢蛋白，转运蛋白，适应性相关蛋白以及其它类型蛋白。利用蛋白质组学方法，比较恶臭假单胞菌浮游态与生物膜形成过程中许多基因差异表达。蛋白质双向凝胶电泳分析表明，与浮游态相比恶臭假单胞菌在生物膜形成早期有532个差异表达的蛋白，在生物膜形成晚期有435个。在早期差异表达的蛋白中，175个蛋白是特异表达的，61个蛋白表达有3倍差距。
　　 本文选取了遗传背景清晰的E.coliBL21(DE3)，用恒流器模拟自然界中流体环境，以低营养的M9盐液为培养基，以玻璃羊毛为吸附介质培养E.coliBL21(DE3)，使其在玻璃羊毛上形成生物膜。通过显微镜观察E.coliBL21(DE3)生物膜形成过程，分析出生物膜形成中的粘附聚集阶段、微菌落形成阶段和生物膜成熟阶段。
　　 选取游离态和生物膜态表达差异较大的三个蛋白，分别为腐胺/精胺转运蛋白的底物结合亚基PotD，与代谢有关的蛋白TldD和谷氨酰胺合成酶，通过过量表达，减量表达和基因敲除的方法，运用激光共聚焦显微镜，研究三个基因对E.coliBL21(DE3)生物膜形成的影响。
　　 通过数据库检索获得EcoliBL21(DE3)potD、tldD、glnA基因的全长序列。利用PCR扩增出potD、tldD、glnA基因，将potD基因与质粒pET26b(+)连接构建出potD基因过量表达载体pET26b(+)-fpotD，将tldD基因和glnA基因分别与质粒pET28a(+)连接构建出tldD基因和glnA基因的过量表达载体pET28a(+)-ftldD和pET28a(+)-fglnA。将三个基因的反义链连接入质粒，构建出反义核酸载体pET26b(+)-ipotD、pET28a(+)-itldD和pET28a(+)-iglnA，反义载体经转录后生成目的基因的反义RNA，与目的基因的mRNA进行互补结合后干扰目的基因的正常表达，从而达到减量表达的效果;运用九-RED同源重组技术对目的基因进行敲除。
　　 将过量表达载体pET26b(+)-fpotD、pET28a(+)-ftldD和pET28a(+)-fglnA转化E.coliBL21(DE3)进行诱导表达，同时用SDS-PAGE验证目的蛋白的表达。减量表达载体pET26b(+)-ipotD、pET28a(+)-itldD和pET28a(+)-iglnA同时转化E.coliBL21(DE3)进行反义RNA转录，运用Westernblotting验证减量表达的效果。利用恒流器培养各蛋白过量表达，减量表达菌株和缺失菌株形成生物膜，观察各生物膜的形成状况，分析目的基因对生物膜形成的影响。
　　 SOS修复是指DNA受到严重的损伤时细胞处于危急状态时被诱导的一种DNA修复方式，修复的结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，故又称为错误倾向修复(error-pronerepair)，使细胞有较高的突变率。许多细菌，包括大肠杆菌，沙门氏菌等，能对DNA损伤或失速的DNA复制产生反应即SOS反应。SOS反应有30多个基因参与，可使细菌增加DNA损伤耐受性及DNA修复能力。LexA蛋白是主要的SOS反应调节剂，作为转录阻遏蛋白行驶功能直至DNA损伤激活RecA。RecA介导LexA自我消化，从而允许SOS基因表达。因此，RecA表达水平可以作为评价SOS反应程度的可靠性指标。多胺（腐胺、亚精胺和精胺）是存在于所有生物体中的脂肪族阳离子。研究被证明多胺通过非共价键交互与蛋白质、核酸、磷脂和其他酸性物质相结合，能够影响细胞膜的透性、基因表达、细胞内信号传导和细胞凋亡。因为他们的重要的监管职能、生物合成、降解吸收，排泄的多胺是严格监管为了保持适当的细胞水平。最近，多胺已被证明调解RecA的生产，配合LexA控制SOS反应调节子。研究人员发现，groES,groEL，tldD，tldE,和gyrA的突变都能提高菌株对CcdB的耐受性，而且在tld缺失菌株中，SOS反应被诱导。虽然TldD和TldE被证明在含有pMccB17质粒的菌株中，与抗生素的分泌有关，但是，tldD和tldE基因位于染色体上，而不是质粒上，而且，除了TldE蛋白之外，没有研究表明其他蛋白质与TldD有相似的作用。为了研究PotD和TldD与SOS系统的关系，实验选取recA，sfiA，oxyR，groES,groEL，gyrA六个与SOS反应相关的基因，以16srRNA为内参，利用RT-PCR分析六个基因在恒流器中PotD0，PotD+，PotDi，PotD-，TldD+，TldD0，TldDi，TldD-的游离态和生物膜中的相对表达，进一步分析PotD和TldD及SOS反应与生物膜形成的关系。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 前言

1．1 生物膜的结构

1．2 生物膜的形成对微生物的影响

1．2．1 为细菌抵抗外界环境提供保护

1．2．2 获取营养物质并进行协同代谢

1．2．3 帮助细菌获得新的遗传物质

1．3 生物膜的形成过程及其影响因素

1．3．1 生物膜的形成过程

1．3．2 生物膜形成的影响因素

1．3．3 密度感应系统(Quorum sensing)

1．3．4 生物膜形成过程中基因差异表达

1．4 生物膜研究的应用前景

1．4．1 生物膜与相关疾病的治疗

1．4．2 生物膜在污染物降解中的应用

1．5 恶臭假单胞菌与单环芳烃的降解

1．6 腐胺的性质、作用及体内代谢途径

1．6．1 腐胺的性质及结构

1．6．2 腐胺的分布及作用

1．6．3 腐胺的体内代谢途径

1．6．4 腐胺转运蛋白系统

1．7 TldD蛋白

1．7．1 TldD与小菌素B17

1．7．2 TldD蛋白与ccdAB系统

1．7．3 TldD的蛋白酶活性

1．8 谷氨酰胺的性质、作用及合成途径

1．8．1 谷氨酰胺的性质及结构

1．8．2 谷氨酰胺的分布及作用

1．8．3 谷氨酰胺的合成途径

1．9 谷氨酰胺合成酶

1．9．1 谷氨酰胺合成酶的性质、作用

1．9．2 谷氨酰胺合成酶的分类

1．9．3 谷氨酰胺合成酶的调控

1．9．4 谷氨酰胺合成酶的酶活测定方法

1．10 SOS系统

1．11 本课题立题依据及主要内容

第二章 单环芳烃降解相关蛋白质在Pseudomonas putida F1利用不同碳源时的差异表达

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．2 结果与讨论

2．2．1 细菌在不同碳源中的生长

2．2．2 蛋白质双向电泳图谱

2．2．3 MALDI-TOF质谱分析

2．3 本章小结

第三章 Escherichia coli中PotD蛋白的过量减量表达及其对生物膜形成的影响

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果与讨论

3．2．1 potD基因的PCR扩增及载体pET26b(+)-fpotD和pET26b(+)-ipotD的构建

3．2．2 载体pET26b(+)-fpotD和pET26b(+)-ipotD转化E．coli DH5α和BL21(DE3)

3．2．3 PotD+的诱导表达和SOS-PAGE验证

3．2．4 PotD蛋白的纯化

3．2．5 游离态生长曲线的测定

3．2．6 PotD0生物膜的形成过程

3．2．7 PotD+生物膜形成状况

3．2．8 PotDi生物膜形成状况

3．2．9 SDS-PAGE和Western blotting检测生物膜中PotD的表达

3．2．10 生物膜形成过程中游离态的生长曲线

3．2．11 恒流器中PotD+，PotD0，PotDi的游离态和生物膜中SOS系统相关基因的相对表达

3．3 本章小结

第四章 Escherichia coli中TldD蛋白的过量减量表达及其对生物膜形成的影响

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 实验方法

4．2 结果与讨论

4．2．1 tldD基因的PCR扩增及载体pET28a(+)-ftldD和pET28a(+)-itldD的构建

4．2．2 载体pET28a(+)-ftldD和pET28a(+)-itldD转化E．coli DH5α和BL21(DE3)

4．2．3 TldD+的诱导表达和SDS-PAGE验证

4．2．4 TldD蛋白的纯化

4．2．5 游离态生长曲线的检测

4．2．6 TldD0生物膜形成状况

4．2．7 TldD+生物膜形成状况

4．2．8 TldDi生物膜形成状况

4．2．9 SDS-PAGE和Western blotting检测生物膜中TldD蛋白的表达

4．2．10 生物膜形成过程中游离态的生长曲线

4．2．11 恒流器中TldD+，TldD0，TldDi的游离态和生物膜中SOS系统相关基因的相对表达

4．3 本章小结

第五章 谷氨酰胺合成酶的过量表达对E．coli BL21(DE3)生物膜形成的影响

5．1 材料与方法

5．1．1 材料

5．1．2 方法

5．2 结果与讨论

5．2．1 谷氨酰胺合成酶基因的PCR扩增及载体pET28a(+)-fglnA的构建

5．2．2 载体pET28a(+)-fglnA在E．coli BL21(DE3)中的表达

5．2．3 谷氨酰胺合成酶在GSI0和GSI+生物膜中的表达

5．2．4 生物膜中谷氨酰胺合成酶过量常量表选时的酶活测定

5．2．5 GSI0和GSI+的生物膜形成状况

5．3 本章小结

第六章 P．putida F1中tldD基因敲除所用同源片段的构建

5．1 材料与方法

5．1．1 材料

5．1．2 方法

6．2 结果与讨论

6．2．1 融合PCR构建tldD gene同源片段tldDkF

6．2．2 融合PCR的引物及反应设计

6．3 本章小结

全文总结

参考文献

在读期间发表论文情况

致谢

外文论文