血浆细胞因子表达水平及尿中金属、多环芳烃暴露水平与成人哮喘的关联性研究

摘要

哮喘是一种以慢性气道炎症、气道高反应性和气管壁重塑为主要特征的慢性呼吸系统疾病，主要表现为反复发作的气短、气喘、胸闷等症状。近年来全球范围内哮喘发病率逐年升高。2013年全球大约有2.35亿人患有哮喘，每年近10万人死于哮喘。2013年我国居民哮喘患病率达到了1.2％，较十年前显著上升，其中北京和上海地区的哮喘发病率分别增高了147.9%和190.2%。为了更好地预防和控制哮喘发病，急需对哮喘的致病因素及发病机制进行深入研究。
　　哮喘发病除了与遗传因素有关，还受到环境因素的影响。既往研究较多的环境因素包括空气颗粒物、环境烟雾等。关于金属或者多环芳烃对哮喘尤其是成人哮喘患病影响的研究仍然较少，且一般采用环境空气监测数据进行暴露评价，最终得到的结论也不一致。本课题组猜想这可能由于金属、多环芳烃广泛存在于空气、土壤和水体中，可经多种途径如呼吸道、消化道、皮肤等进入人体。单一进行环境空气或者食物暴露评价难以准确反映人体接触金属和多环芳烃的实际暴露量，影响了其与哮喘关系的分析。相比之下，生物监测方法可更为准确而全面地反映人体实际接触环境毒物的水平，通过该方法分析和评估环境毒物暴露与健康的关联也更可信。尿液因其采集方便、易获得、无损伤等特点，是大样本环境和职业暴露研究中比较常用的生物样本。由于金属和多环芳烃主要经尿液排出体外，因此本研究拟选取成人哮喘病例和健康对照作为研究对象，通过检测尿中金属及多环芳烃代谢产物的浓度评估个体暴露水平，进一步分析金属和多环芳烃暴露与成人哮喘患病的可能关联。
　　炎症反应是哮喘的典型病理特征。许多炎性细胞因子均被证实与哮喘发病有关，并且在此基础上衍生了诸多假说如Th1/Th2比例失衡等，但目前并没有一个假说能完全解释哮喘的发病机制。本研究试图通过采用高通量蛋白芯片检测成人哮喘病例和健康对照血浆中280种细胞因子，筛选出哮喘相关的新的细胞因子，同时探讨这些细胞因子在环境因素诱发哮喘过程中的作用。
　　本研究的目的主要包括：（1）发现及验证与哮喘相关的新的细胞因子，分析其与成人哮喘患病及哮喘严重程度的关联；（2）探讨环境毒物如金属、PAHs暴露水平与成人哮喘患病之间可能存在的关联。主要包括三部分：（1）采用高通量蛋白芯片技术筛查8名哮喘病人和16名健康对照血浆中280种细胞因子的表达水平，筛选出在两组间表达有差异的细胞因子，并结合文献挑选出5个细胞因子，进而在1009对成人哮喘病例-对照研究人群中进行验证，探讨新筛选出的细胞因子与成人哮喘患病之间关联；（2）选择1009对成人哮喘病例-对照人群中已收集尿样的人作为研究对象，按年龄、性别匹配后，检测尿液样本中22种金属水平，探讨金属暴露水平与成人哮喘患病之间的关联；（3）检测成人哮喘病例和对照人群尿中10种多环芳烃代谢产物，分析多环芳烃暴露水平与成人哮喘患病以及细胞因子表达水平之间的关联。
　　第一部分、血浆细胞因子表达水平与成人哮喘的关联性研究
　　目的：筛选成人哮喘病例与健康对照间差异性表达的细胞因子，并分析其与成人哮喘患病及哮喘严重程度之间的关联。
　　方法：2010年10月至2012年1月间，在武汉市某三甲医院呼吸内科选取确诊的哮喘病人作为病例。在与病例同地区居住的社区人群中挑选健康对照。哮喘病例和健康对照各1009例，均为成人，按性别、年龄（±5岁）进行1:1匹配。研究对象均接受问卷调查，收集既往职业史、个人和家庭疾病史以及生活习惯等。对于哮喘病例，主要收集其发病前的信息。哮喘病例及对照均进行体格检查。在总人群中挑选8名非吸烟哮喘病例和16名性别、年龄匹配的非吸烟健康对照，采用高通量蛋白定量芯片技术，筛选在病例和对照血浆中差异性表达的细胞因子。结合哮喘发病的相关文献，选择5种细胞因子在1009对病例-对照人群中进行验证。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测外周血血浆中5种细胞因子水平。比较哮喘病例组和健康对照组之间人口学特征和临床指标的差异，连续型变量采用t检验，分类变量采用卡方检验。采用 Wilcoxon符号秩和检验比较细胞因子在哮喘病例和健康对照人群中的分布差异，用Spearman秩和相关分析方法分析细胞因子之间的相关性。采用条件logistic回归模型分析5种细胞因子与哮喘患病之间的关系。将哮喘病例分为持续发作期病例和间歇发作期病例，采用非条件 logistic回归模型分析5种细胞因子表达与哮喘严重程度之间的关系。
　　结果：筛选过程最终选择了CA15-3、CCL11、CD14、Adipsin和IL-9五种细胞因子。验证人群中，哮喘病例组中男性占41.53%，平均年龄为44.48±14.71岁；健康对照组中男性占41.53%，平均年龄为45.15±15.12岁；哮喘病例分为间歇发作（596例，59.1%）和持续发作（413例，40.9%）两个亚组。
　　与健康对照组相比，哮喘病例中有哮喘家族史者比例（10.41%）较高，而吸烟（11.89%）、饮酒者（10.61%）比例较低，差异有统计学意义（P<0.0001）。哮喘病例的肺功能指标均低于对照组，且差异有统计学意义（P<0.0001）。哮喘病例和健康对照在饲养宠物、种植花草以及BMI指数方面无显著差异。
　　哮喘病例血浆中 IL-9的表达水平比健康对照高，且持续发作期高于间歇发作期（P<0.0001）。哮喘病例血浆中CCL11、CD14和Adipsin的表达水平比在健康对照组低，且持续发作期低于间歇发作期（P<0.0001）。哮喘病例血浆中CA15-3的表达水平比健康对照高，持续发作期高于间歇发作期，但差异没有统计学意义（P>0.05）。采用logistic回归模型分析发现，CA15-3和IL-9表达水平升高可能与成人哮喘患病增加有关；CCL11、CD14和Adipsin表达水平降低可能与成人哮喘患病减少以及哮喘严重程度降低有关。
　　结论：CA15-3、CCL11、CD14、Adipsin和IL-9五种细胞因子与成人哮喘患病之间存在一定的关联，具体机制有待进一步研究。
　　第二部分、尿中金属暴露水平与成人哮喘的关联性研究
　　目的：比较成人哮喘病例和健康对照尿液中22种金属暴露水平，探讨金属暴露与成人哮喘患病之间的关联。
　　方法：包括551名成人哮喘病例和551名健康对照，按年龄、性别1:1匹配。收集研究对象基本信息并进行体格检查。对于哮喘病例，主要收集其发病前的信息。采用电感耦合等离子体质谱联用仪检测尿液样本中22种金属的暴露水平，并用肌酐进行校正。比较哮喘病例组和健康对照组之间人口学特征和临床指标的差异，连续型变量采用t检验，分类变量采用卡方检验。采用Wilcoxon符号秩和检验比较尿中金属浓度在哮喘病例和健康对照人群中的差异，用 Spearman秩和相关分析方法分析金属之间的相关性。采用logistic模型分析尿中金属浓度与哮喘患病之间的关联。
　　结果：哮喘病例和健康对照人群中男性占43.01%。哮喘病例组平均年龄为42.41±12.56岁，健康对照组平均年龄为42.74±12.80岁，差异没有统计学意义（P=0.3769）。哮喘病例组BMI指数（23.02±3.46 kg/m2）低于健康对照组（24.00±3.66 kg/m2），差异有统计学意义（P<0.0001）。哮喘病例中急性期和缓解期病例分别为357例（64.79%）和194例（35.21%）。哮喘病例组中有哮喘家族史者比例（11.25%）高于健康对照组（2.00%），但吸烟者比例（12.52%）低于健康对照组（23.96%），差异有统计学意义（P<0.0001）。除FVC(%预测值)外，哮喘病例肺功能指标均低于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.0001）。
　　哮喘病例组尿液中铬、铜、砷、硒、锶、钼、镉、锡、锑、钨和铀共11种金属浓度的几何平均数高于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.005）；哮喘病例尿液中铝、钒、锰、铁、镍、锌、铷、钡、铊和铅共10种金属浓度的几何平均数低于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.005）。尿钴的浓度在病例和对照两组间的差异没有统计学意义（P=0.8720）。
　　经过logistic回归模型分析，最终发现13种金属与成人哮喘患病有关，其中尿铬、铜、硒、钼、镉和铀等6种金属水平升高可能是成人哮喘患病的危险因素，OR值（95%置信区间）分别为4.76（2.97-7.62）、5.89（3.18-10.90）、10.43（4.74-22.95）、3.48（2.15-5.62）、1.71（1.03-2.85）和7.26（4.55-11.59）。尿锰、铁、镍、锌、铷、钡和铅等7种金属水平升高可能减少成人哮喘患病危险度，OR值（95%置信区间）分别为0.25（0.15-0.42）、0.38（0.24-0.59）、0.29（0.21-0.40）、0.40（0.24-0.65）、0.08（0.04-0.16）、0.46（0.29-0.74）和0.44（0.27-0.74）。将急性发作期哮喘病例和缓解期病例分别和健康对照组比较时，上述13种金属在哮喘病例和对照人群中的暴露水平差异不变。
　　结论：尿中不同金属的暴露水平与成人哮喘之间的关联不同，其中尿铬、铜、硒、钼、镉、铀水平升高可能是成人哮喘患病的危险因素，尿锰、铁、镍、锌、铷、钡、铅水平升高可能减少成人哮喘患病。
　　第三部分、尿中多环芳烃代谢产物水平与成人哮喘的关联性研究
　　目的：比较成人哮喘病例和健康对照尿液中多环芳烃代谢产物-羟基多环芳烃水平，探讨多环芳烃暴露与成人哮喘患病之间的关联。
　　方法：研究对象包括507名成人哮喘病例和536名健康对照。收集研究对象基本信息并进行体格检查。对于哮喘病例，主要收集其发病前的信息。采用气相色谱-质谱联用仪检测尿液样本中10种羟基多环芳烃的水平，并用尿肌酐浓度进行校正。采用ELISA方法检测血浆中CA15-3、CCL11、CD14、Adipsin和IL-9的表达水平。比较哮喘病例组和健康对照组之间人口学特征和临床指标的差异，连续型变量采用t检验，分类变量采用卡方检验。采用 Wilcoxon符号秩和检验比较羟基多环芳烃和五种细胞因子在两组人群中的分布差异。用Spearman秩和相关分析方法分析10种羟基多环芳烃之间以及羟基多环芳烃与细胞因子之间的相关性。采用非条件 logistic回归模型分析尿中羟基多环芳烃与哮喘患病之间的关系，并用广义线性模型分析总羟基多环芳烃和细胞因子之间的关系。多重比较采用阳性错误发现率校正P值。
　　结果：哮喘病例和对照中男性比例分别为43.79%和43.28%。病例和对照两组平均年龄分别为42.09±12.89岁和42.76±12.51岁。两组之间在年龄、性别方面没有明显差异。哮喘病例BMI指数（23.00±3.61 kg/m2）低于对照组（24.01±3.67 kg/m2），差异有统计学意义（P<0.0001）。哮喘病例组中有哮喘家族史者比例（10.45%）高于对照组（2.05%），但吸烟者比例（12.62%）低于对照组（24.07%），差异有统计学意义（P<0.0001）。除 FVC（%预测值）外，哮喘病例肺功能指标均低于对照组，差异有统计学意义（P<0.0001）。
　　相关分析显示尿中10种羟基多环芳烃之间呈显著正相关(P<0.0001)。哮喘病例尿液中2-羟基芴、4-羟基菲、1-羟基菲、2-羟基菲、1-羟基芘暴露水平高于对照组（P<0.005），2-羟基萘和9-羟基芴暴露水平低于对照组（P<0.05）。其余羟基多环芳烃及总羟基多环芳烃在哮喘病例和健康对照间差异没有统计学意义（P>0.05）。作为连续型变量或者四分位后纳入logistic回归模型分析显示，2-羟基芴、4-羟基菲、1-羟基菲、2-羟基菲和1-羟基芘暴露水平升高可能是成人哮喘患病的危险因素，2-羟基萘和9-羟基芴暴露水平升高可能与成人哮喘患病减少有关，总羟基多环芳烃暴露水平升高与成人哮喘患病有关联，但无统计学意义(OR=1.23，95%CI：0.97-1.56)。哮喘病例组中IL-9浓度高于健康对照组，哮喘病例组CCL11、CD14和Adipsin浓度低于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.0001），CA15-3在两组人群中的分布差异没有统计学意义（P=0.0834）。广义线性模型分析显示血浆中五种细胞因子与尿中总羟基多环芳烃之间的剂量反应关系没有统计学意义。
　　结论：PAHs暴露可能与成人哮喘患病有关。10种代谢产物中2-羟基芴、4-羟基菲、1-羟基菲、2-羟基菲、1-羟基芘暴露水平升高可能是成人哮喘患病的危险因素，2-羟基萘、9-羟基芴暴露水平升高可能与成人哮喘患病减少有关。
　　本研究在大样本的哮喘病例和健康对照人群中发现，血浆中 CA15-3、CCL11、CD14、Adipsin和IL-9表达水平和尿液中某些金属、PAHs暴露可能与成人哮喘患病有关，为哮喘发病机制研究积累数据。研究的创新之处包括：（1）通过筛检和验证研究，发现血浆中 CA15-3表达水平升高可能与成人哮喘患病有关，血浆中 Adipsin表达水平降低可能与成人哮喘患病减少及哮喘严重程度降低有关；（2）尿铬、铜、硒、钼、镉、铀水平升高可能是成人哮喘患病的危险因素，尿锰、铁、镍、锌、铷、钡、铅水平升高可能减少成人哮喘患病危险度；（3）PAHs暴露可能与成人哮喘患病有关，10种代谢产物中2-羟基芴、4-羟基菲、1-羟基菲、2-羟基菲、1-羟基芘暴露水平升高可能是成人哮喘患病的危险因素，2-羟基萘、9-羟基芴暴露水平升高可能与成人哮喘患病减少有关。

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英文缩写

中文摘要

英文摘要

前言

技术路线图

第一部分 血浆细胞因子表达水平与成人哮喘的关联性研究

一、对象和方法

二、结 果

三、讨 论

四、小 结

第二部分 尿中金属暴露水平与成人哮喘的关联性研究

一、对象和方法

二、结 果

三、讨 论

四、小 结

第三部分 尿中多环芳烃代谢产物水平与成人哮喘的关联性研究

一、对象和方法

二、结 果

三、讨 论

四、小 结

结论

下一步研究计划

参考文献

综述: 环境毒物对过敏性哮喘的影响

致谢

附录一