异源D-海因酶和N-氨甲酰水解酶共表达重组枯草芽孢杆菌的构建

摘要

D-对羟基苯甘氨酸是半合成β-内酰胺类抗生素的重要原料，海因酶法是普遍采用的D-对羟基苯甘氨酸工业生产方法。海因酶法就是采用D-海因酶和N-氨甲酰水解酶催化D, L-对羟基苯海因，转化为D-对羟基苯甘氨酸的生物化学方法。本文以枯草芽孢杆菌为受体菌，共表达异源的D-海因酶和 N-氨甲酰水解酶，作为海因酶法合成 D-对羟基苯甘氨酸的全细胞催化剂。本文对于D-海因酶的选择、重组菌的构建和影响全细胞催化活性的一些重要因素进行了研究。
　　采用Paco表达盒诱导表达D-海因酶基因（sd1或hyd），采用PAE表达盒表达N-氨甲酰水解酶基因（adc）。以质粒pHP13为载体，分别构建PAE-adc-Paco-sd1基因和PAE-adc-Paco-hyd基因共表达质粒 pHCY和 pHCS。枯草芽孢杆菌168/pHCY和168/pHCS的全细胞催化活性，分别为0.25 U/mL和0.36 U/mL。
　　在枯草芽孢杆菌168N的染色体上，整合表达acoR基因和sigL基因，构建了重组菌株WD-3。qRT-PCR分析显示，WD-3菌株胞内acoR和sigL基因的mRNA水平平均提高了248.2倍和80.7倍，表明acoR和sigL基因在WD-3菌株中被过表达。WD-3/pHCS菌株的全细胞催化活性达到0.56 U/mL，比168/pHCS提高了80％。结果表明，提高激活蛋白AcoR和σL因子的胞内水平，对于维持多拷贝Paco表达盒的正常转录功能是必要的。
　　以pUB110质粒为基础，构建了adc-sd1共表达重组质粒pUCS。WD-3/pUCS全细胞催化活性达到0.98 U/mL，比WD-3/pHCS的0.56 U/mL提高了75%。结果表明，提高adc和sd1基因剂量，对于提高重组菌的全细胞催化活性是有效的。
　　敲除WD-3菌株的sdp和skf基因，构建双缺陷株WD-5。WD-5/pUCS菌株与WD-3/pUCS相比，全细胞催化活性相当；但是在培养体系和催化反应体系中，芽孢量会高一个数量级；在反应体系中，全细胞催化活性的衰减速率显著降低。因此，sdp和skf基因缺陷，虽然导致更多的细胞形成芽孢，但是由于消除了姊妹细胞之间的自相残杀，而有利于全细胞催化活性的维持。
　　敲除WD-5菌株的kinA和kinB基因，构建重组菌WD-7。WD-7/pUCS完全不形成芽孢，同时具有与WD-5/pUCS菌株相当的全细胞催化活性和衰减特征。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 细菌来源的D-海因酶及酶学特性

1.1.1 D-海因酶的结构和性质

1.1.2 不同来源的D-海因酶的特点

1.2 N-氨甲酰水解酶

1.3 海因酶法制备D-对羟基苯甘氨酸

1.3.1 海因酶法

1.3.2 海因酶法制备D-对羟基苯甘氨酸

1.4 羟基丁酮诱导表达系统

1.4.1 acoABCL操纵子的结构

1.4.2 acoR基因与AcoR激活蛋白

1.4.3 sigL基因

1.4.4 acoABCL操纵子的表达调控机制

1.5 影响枯草芽孢杆菌芽孢形成的关键基因

1.5.1 枯草芽孢杆菌的芽孢形成机制

1.5.2 枯草芽孢杆菌的芽孢形成的关键基因

1.6 本文的研究目的和意义

第二章 材料与方法

2.1.1 菌株和质粒

2.1.2 PCR引物与合成片段

2.1.3 主要药品

2.1.4 主要试剂

2.1.5 培养基

2.1.6 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 B. subtilis染色体DNA的提取

2.2.2 CTAB法提取质粒

2.2.3 DNA片段的PCR扩增

2.2.4 重叠PCR反应[62]

2.2.5 琼脂糖凝胶电泳

2.2.6 DNA的切胶纯化与回收

2.2.7 DNA的酶切反应

2.2.8 DNA的连接反应

2.2.9 B. subtilis的感受态转化

2.2.10 E. coli感受态的转化

2.2.11 超声法细胞破碎方法

2.2.12 茚三酮法检测D-对羟基苯甘氨酸

2.2.13 PDAB定性检测N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸

2.2.14 高压液相色谱测定D-对羟基苯甘氨酸

2.2.15 海因酶和氨甲酰水解酶总酶活的测定

2.2.16 DNA片段的合成与测序

2.2.17 基因的无标记修饰方法

2.2.18 菌种的保藏

2.2.19 细胞总RNA的提取

2.2.20 cDNA的扩增和实时荧光定量PCR

2.2.21活菌计数及芽孢计数方法

第三章 结果与分析

3.1 D-海因酶的比较和选择

3.1.1 D-海因酶序列的比较

3.1.2 重组质粒pHCY和pHCS的构建

3.1.3 重组质粒的转化和海因酶活性比较

3.2 acoR和sigL基因过表达菌株的构建及对催化活性的影响

3.2.1 acoR过表达菌株的构建

3.2.2 sigL过表达菌株的构建

3.2.3 acoR和sigL过表达菌株的构建

3.2.4 WD-3菌株acoR和sigL基因的相对表达水平

3.2.5 acoR和sigL基因过表达对全细胞催化活性的影响

3.3 增加adc和sd1基因拷贝数对全细胞催化活性的影响

3.3.1 高拷贝重组质粒pUCS的构建及转化

3.3.2 重组菌株的胞内聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

3.4 sdp和skf的敲除及其对全细胞催化活性的影响

3.4.1 sdp基因的敲除

3.4.2 skf基因的敲除

3.4.3 sdp和skf基因的敲除对全细胞催化活性的影响

3.5 芽孢形成缺陷对全细胞催化活性的影响

3.5.1 kinA基因的敲除

3.5.2 kinB基因的敲除

3.5.3 kinA和kinB基因缺陷的效应

第四章 结论与展望

4.1 主要结论

4.2 创新点

4.3 展望

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

致谢