牛免疫缺陷病毒跨膜糖蛋白跨膜区及胞内区研究

摘要

牛免疫缺陷病毒(BIV)可以在牛群中自发感染，引起牛免疫系统的紊乱，进而造成一系列次级反应，影响奶牛的产奶量，危害牛群健康。另外该病毒在世界范围内流行，欧洲、北美、亚洲等地牛群中均有发现。BIV包膜蛋白包括表面糖蛋白(SU)gp100和跨膜糖蛋白(TM)gp45。目前，表面糖蛋白的结构区已经确定，但是对于跨膜糖蛋白的研究非常少。
　　 本研究通过NCBI数据库获得BIV包膜糖蛋白(Env)的序列，并通过查阅相关文献，确定跨膜糖蛋白的具体序列。在此基础上，使用生物信息学的方法，结合跨膜区的特征，初步预测有2个区域可能为跨膜区(MSD);然后，与在结构、遗传、生物学性质和致病性等方面与该病毒相似的I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的跨膜糖蛋白相应区域进行比较分析;最后通过一系列细胞亚定位的生物学实验，初步确定了BIV的MSD区为包膜糖蛋白第725～746位氨基酸DWIK(IIIVII)VLWLLIKILLGM。根据env上各基因分布，MSD的5'后的区域即为牛免疫缺陷病毒的胞内区（CD）部分。通过序列分析确定CD区后，同样通过类比的方式运用细胞定位的方法确定预测的区域正确。在实验过程中发现整个胞内区转染入细胞后，会造成其在细胞中特定细胞器聚集分布。为了确定引起这种分布的关键区域，本实验构建一系列截短突变，进行细胞亚定位分析，最终确定了2个肽段，即包膜糖蛋白第809～819位氨基酸NSLRILFATCR及第841～849位氨基酸LLWDIFRHA对于该现象具有重要作用。它们的缺失会造成这种现象消失。同时，本研究对Env在细胞中的合成及运输过程中经过细胞器的情况分析，分别对细胞核、内质网、高尔基体进行染色，最终确定这种集中分布主要位于内质网的近核膜端。
　　 跨膜糖蛋白的跨膜区及胞内区对于病毒的生命周期有重要的作用，对于HIV-1中相应区域的功能已有一定的研究。本研究通过生物信息学及生物学实验的方法，对于BIV进行了初步研究，可以丰富和完善人们对慢病毒Env及其功能的认识。同时，Env是病毒感染宿主细胞过程中最先暴露于宿主免疫系统的部分，因此对于它的研究有助于BIV疫苗的研发，从而对于整个畜牧业产量的提高有潜在的价值。

目录

声明

摘要

第一章 引言

第一节 慢病毒及相关病毒简介

1．1．1 慢病毒概述

1．1．2 本文所涉及的相关病毒

第二节 包膜糖蛋白及相关功能区介绍

1．2．1 包膜糖蛋白的结构与功能

1．2．2 包膜糖蛋白的合成及运输过程

1．2．3 BIV跨膜糖蛋白的跨膜区及胞内区

第三节 本研究的目的和意义

1．3．1 本研究的前期基础

1．3．2 本研究的目的和意义

第二章 材料与方法

第一节 实验材料

2．1．1 仪器

2．1．2 菌株

2．1．4 细胞系

2．1．4 质粒

2．1．5 实验试剂

2．1．6 实验主要溶液配方

第二节 实验方法

2．2．1 跨膜糖蛋白跨膜区MSD的预测

2．2．2 克隆构建

2．2．3 细胞实验

第三章 结果与分析

第一节 BIV跨膜糖蛋白跨膜区的确定

3．1．1 BIV跨膜糖蛋白的跨膜区(MSD)的预测

3．1．2 通过基因结构分析进一步确定跨膜区(MSD)可能区段

3．1．3 通过类比的方法最终确定预测的MSD正确

3．1．4 通过胞内区的定位情况验证预测的MSD正确

第二节 BIV gp45CD集中分布区的确定

3．2．1 构建BIV gp45CD的截短突变

3．2．2 引起gp45CD的集中分布的关键区的确定

第三节 gp45CD分布位置的确定

3．3．1 通过Hoechst33342核染确定与细胞核共定位情况

3．3．2 通过内质网染色确定与内质网共定位情况

3．3．3 通过高尔基体染色确定与高尔基体共定位情况

第四章 讨论

第一节 牛免疫缺陷病毒BIV的研究现状

第二节 Env蛋白中的两个区域MSD及CD是跨膜糖蛋白关键的功能区

第三节 有待进一步解决的科学问题

第五章 结论

参考文献

致谢

附录

个人简历