鳗弧菌铁调节外膜蛋白的免疫效果及五种致病性弧菌铁调节外膜蛋白表达的研究

摘要

本试验分为两部分，第一部分针对海水鱼类养殖过程中常见的致病性鳗弧菌株L-18株，考察其在限铁条件下的生长情况及铁载体、铁调节外膜蛋白(IROMP)的表达，并比较全菌疫苗、外膜蛋白(OMP)和IROMP的免疫效果，为从铁摄取系统方面研发新型疫苗提供参考；第二部分研究了五种常见致病性弧菌鳗弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌和河流弧菌的限铁生长条件，并比较了其铁调节外膜蛋白表达的差异，为研究其铁摄取系统的交叉反应及交叉保护，进而研制可能的多价或联合疫苗提供数据。免疫部分的试验在中国水产科学院黄海水产研究所麦岛试验基地进行。 1.以一株从患病牙鲆体内分离到的鳗弧菌L-18株作为研究对象，考察了其在限铁培养条件下的铁摄取系统的表达，通过免疫印迹试验考察了IROMPs的免疫原性，并通过主动免疫比较了全菌灭活疫苗、OMPs、IROMPs对牙鲆的免疫保护力。结果表明，在TSB培养基中加入不同浓度的2,2'-联吡啶，L-18株的生长表现出一定的规律；验证了儿茶酚类铁载体和74.3ku、77.4ku IROMPs的表达；免疫印迹试验表明，77.4ku IROMPs具有免疫原性；免疫牙鲆的试验结果表明，各疫苗的免疫保护力为：全菌疫苗79.3％，OMPs疫苗51.8％，IROMPs疫苗75.9％，IROMPs的免疫保护力显著高于OMPs。虽然IROMPs与OMPs的血清杀菌活力没有显著差异，但其抗体效价却显著高于OMPs。因此，鳗弧菌L-18株的IROMPs是一种良好的免疫原，能够显著提高OMPs的免疫保护力，可能成为一种新型高效的疫苗。 2.考察了五种致病性弧菌：鳗弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌和河流弧菌的适宜的限铁生长条件，以及所表达IROMPs的异同。结果表明，以TSB+2,2'-联吡啶为限铁培养基，各种弧菌的适宜限铁生长条件有较大差异，其对2,2'-联吡啶的要求是：鳗弧菌为100～130 μmol·L<'-1>，副溶血弧菌250 μmol·L<'-1>，溶藻弧菌150μmol.L<'-1>，哈维氏弧菌130μmol·L<'-1>，河流弧菌150μmol·L<'-1>。五种弧菌在限铁条件下，均可表达各自的IROMPs：鳗弧菌表达出74.3ku、77.4ku IROMPs； 鳗弧菌铁调节外膜蛋白的免疫效果及五种致病性弧菌铁调节外膜蛋白表达的研究副溶血弧菌是68.4ku、71.2ku、72.9ku、74.3ku、77.0ku数种蛋白的加强表达；溶藻弧菌是70.4ku、72.9ku、74.5ku和77.0ku数种蛋白的加强表达，并表达出新的81.1ku和84.8ku蛋白；哈维氏弧菌新增表达了82.0ku和83.6ku蛋白；河流弧菌新增表达了77.4ku和82.7ku蛋白。参照电泳图谱，五种弧菌的IROMPs都出现在约70.4ku～84.8ku的范围内，并且某些蛋白带具有一定的相似性，比如鳗弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌都表达了约74.5ku和77.0ku的蛋白；另外溶藻弧菌、哈维氏弧菌和创伤弧菌都新增表达了约81.1ku-82.7ku。的蛋白，不排除相似分子量的蛋白就是一种蛋白的可能。能否据此推测某些弧菌利用相同的蛋白摄取铁，进而利用此点开发针对弧菌的高效多价疫苗，还有大量的工作要做。 本文在前人对鳗弧菌IROMPs结构和特性的研究基础上，首次考察了鳗弧菌IROMPs的免疫效果，发现其免疫效果与OMPs相比有大幅度提高；首次从同属内种间差异角度对五种弧菌的IROMPs进行了比较，并发现了其异同之处。本文填补了弧菌IROMPs的免疫效果领域的空白，为开发新型渔用弧菌病疫苗提供一种思、路，并为研究数种弧菌很可能存在的共有的摄铁机制提供依据，为开发铁摄取系统相关的弧菌多价疫苗提供理论基础。

目录

声明

摘要

第一章前言

1鳗弧菌铁摄取系统研究进展

1.1鳗弧菌质粒编码的铁摄取系统

1.2鳗弧菌染色体编码的铁摄取系统

2水产动物致病菌铁摄取系统研究进展

2.1溶藻弧菌的铁摄取系统

2.2杀鲑气单胞菌的铁摄取系统

2.3海洋屈挠杆菌的铁摄取系统

2.4鲁氏耶尔森氏菌的铁摄取系统

参考文献

第二章鳗弧菌L-18株的限铁条件和铁调节外膜蛋白的免疫反应性研究

1材料与方法

1.1试验材料

1.2培养基

1.3限铁条件试验

1.4铁载体的检测

1.5 OMPs和IROMPs的提取

1.6抗血清的制备

1.7 OMPs和IROMPs的SDS-PAGE

1.8 OMPs和IROMPs的WESTERN-BLOT

2结果

2.1L-18株限铁培养基的确定和铁载体的检测

2.2 IROMPs的表达

2.3 IROMPs的反应原性

3讨论

3.1 L-18株的限铁条件

3.2 L-18株OMPs和IROMPs的免疫原性

参考文献

第三章鳗弧菌L-18株铁调节外膜蛋白对牙鲆的免疫效果研究

1材料与方法

1.1试验材料

1.2培养基

1.3 OMPs和IROMPs的提取

1.4对牙鲆的主动免疫

1.5血清凝集反应

1.6血清杀菌试验

1.7统计分析

2结果

2.1免疫保护力

2.2抗体效价

2.3血清杀菌活力

3讨论

参考文献

第四章水产动物主要致病弧菌铁调节外膜蛋白的限铁条件和表达研究

1材料与方法

1.1试验材料

1.2培养基

1.3限铁条件试验

1.4 OMPs和IROMPs的提取

1.5 SDS-PAGE

2结果

2.1五种弧菌的限铁条件

2.2 IROMPs的表达

3讨论

参考文献

附录

致谢