铁离子调节革兰氏阴性菌外膜蛋白OmpW抗宿主氧化应激作用及机制的研究

摘要

革兰氏阴性菌是造成感染性疾病的主要致病菌,其少数的外膜蛋白是毒力因子,有抵抗宿主免疫的作用,在毒力发挥和感染宿主的过程中发挥极其重要的作用。
　　 动物的先天性免疫是抵抗病菌感染的主要方式,而这种免疫作用的维持依赖于铁离子介导的芬顿(Fenton)反应。机体通过芬顿反应产生低水平的自由基,进而造成氧化应激环境,杀死并清除入侵的病原菌,保证机体的健康。一旦铁代谢失调造成机体内游离的铁离子过多,不但会促进入侵的细菌生长、毒力增强,还会产生大量的自由基,如果机体由于生理或病理原因不能及时清除掉这些产生的自由基而使其处于较高水平,就会形成氧化应激,损伤正常细胞,影响机体的正常代谢,造成各种疾病,严重时会危及生命的安全。此外少数外膜蛋白可以激活宿主免疫系统,保护生物体健康。具有免疫原性的OmpW是大多数革兰氏阴性菌外膜蛋白家族成员之一,也是革兰氏阴性菌毒力因子之一,与细菌对宿主的感染密切相关。鉴于铁离子和氧化应激在免疫及细菌感染方面的重要作用,从细菌抵抗宿主免疫这一角度来探讨感染与免疫的关系,揭示感染性疾病新的发病机制就显得尤为重要。
　　 本课题从氧化应激的角度探索铁离子对革兰氏阴性菌外膜蛋白OmpW表达的影响,深入理解细菌与宿主氧化应激之间的相互作用,进而为革兰氏阴性菌新的致病机制的研究提供理论基础,对感染性疾病的控制、治疗具有重要的理论和实践意义。本课题首先构建pLLP-OmpA-ompW重组质粒,转化大肠杆菌K12感受态细胞得到外膜上高表达OmoW蛋白的高表达菌(以下简称高表达菌)。同时通过构建载体和转化的手段获得高表达OmpW蛋白的胞浆高表达菌,提取并纯化该蛋白用于免疫小鼠以制备抗血清。再次通过铁离子限制条件下,正常菌(K12菌)、敲除菌、高表达菌在氧化应激环境中存活率的变化来反映细菌抗氧化应激作用的强弱,并测定这3种菌在同等时间内细菌细胞对二价铁离子摄入的差异。最后通过Western blot反映铁离子和氧化应激对K12菌OmpW蛋白表达的影响。
　　 本课题的研究表明:3种菌在正常培养时高表达菌对H2O2氧化应激的耐受能力较强,K12菌次之,敲除菌最弱,在铁离子限制处理的条件下这3种菌耐受H2O2氧化应激的总体趋势基本没变,但略有下降。正常菌在铁离子限制条件下对H2O2氧化应激耐受能力降低。细菌对铁离子摄入实验中,高表达菌摄入的铁离子较多,而敲除菌对铁离子的摄入最少。铁离子和H2O2氧化应激可以调节细菌OmpW蛋白的表达量,通过Western blot实验证实,K12菌在铁离子限制的条件下没有检测到OmpW蛋白表达,而过量的铁离子或H2O2氧化应激使OmpW蛋白表达量增加。由此可见,细菌通过对铁离子摄入量的调节,上调Ompw蛋白的表达来抵抗宿主氧化应激的杀菌作用,从而逃避宿主免疫求得生存。
　　 综上所述,铁离子可以上调革兰氏阴性菌OmpW蛋白的表达量抗宿主氧化应激作用,逃避宿主免疫系统的杀伤,增强其生存的能力与感染的机会。本课题的研究揭示了革兰氏阴性病原菌一种新的致病机制,为抗菌药和疫苗的研发提供理论基础,具有重要的现实意义。