基于化学衍生化的蛋白质N-糖链质谱鉴定新方法研究

摘要

糖类在生物合成、结构和功能上都与核酸以及蛋白质有着本质区别。蛋白质的N-糖链在生物功能中起着重要的作用,如细胞粘附、信号转导和分子识别。糖基化蛋白糖链在蛋白质折叠、定位及蛋白间的相互作用中具有重要的意义。研究健康和疾病个体N-糖链组成的差异可以作为疾病预测和诊断的生物标志物,例如神经退行性疾病,代谢性疾病和肿瘤。因此,研究蛋白质的糖基化修饰及其在不同生理病理条件下的变化有重要意义。
　　然而,蛋白质糖基化是一个极度复杂的动态生物过程,导致合成的糖链在相同位点具有极大的不均一性,单糖组成和连接方式的多变性使多糖成为最复杂的一种生物大分子之一。因此,精确剖析糖基化蛋白糖型结构,进而探索其生物学意义是糖蛋白质组学面临主要问题和巨大挑战。多种技术已经被应用于糖基化蛋白质中糖链的研究,例如色谱法、芯片法、核磁共振法、毛细管电泳法等,其中质谱技术已经成为糖链结构分析最有力的工具。然而糖链结构中多羟基所具有的强亲水性导致了其在质谱中离子化效率低,检测灵敏度不高等,严重阻碍了质谱对糖链的鉴别和结构分析。为此常采用衍生化处理,改变糖分子的局部结构,提高其在质谱检测中的离子化效率,增强检测灵敏度,降低检测限。目前已有大量标记试剂被用于糖类化合物的衍生化,但在实际应用中大都存在着这样或那样的缺点,因此开发高灵敏的标记试剂意义重大。
　　本研究针对上述问题展开研究。重点发展了基于化学修饰的糖链结构质谱鉴定新策略。首先,我们依据糖的还原端胺化反应原理,对30种商品化试剂进行筛选,通过对其疏水性、碱性、反应基团和带电性等方面进行考察,得到两种强疏水性芳稠环试剂,分别为1-芘丁酸酰肼(PBH)和溴化乙锭(EB)。通过对标准寡糖和标准糖蛋白的N-糖链进行衍生化,考察了这两种试剂的衍生化效率和检测灵敏度。在优化的反应条件下,PBH和EB的衍生化效率均高于98％。寡糖经过衍生化后,在质谱中的信号强度分别提高了13倍和17倍。在基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOFMS)中的检测限分别降至8fmol和6fmol。标准糖蛋白衍生化后,鉴定的糖型数量显著增加。特别是EB衍生化试剂,其自身携带的阳离子对含有唾液酸结构的糖链的质谱鉴定灵敏度有显著改善,该试剂是首次被应用于糖链的衍生化。
　　在此基础上,我们又设计合成了两个新的衍生化试剂,溴化(丁酰肼-4-基)-三苯基磷鎓盐(TPP-PrG)和α-N-苯甲酰基-L-精氨酸酰肼(BRh)。采用标准寡糖DP7对其衍生化效率和检测灵敏度进行考察,新合成试剂TPP-PrG和BRh的寡糖衍生化效率高达98%以上,质谱检测信号分别提高了70和35倍。在MALDI-TOFMS中的检测限分别降至1.4fmol和2.8fmol。
　　为了评价合成的新型衍生化试剂在复杂样本中应用的可行性,我们采用健康人血清经PNGaseF酶切的N-糖链混合物,考察新试剂TPP-PrG和BRh对糖链质谱鉴定效果的影响,并与商品衍生化试剂异烟肼(INH)衍生物的质谱鉴定效果相比较。血清蛋白质的组成异常复杂,高低丰度蛋白质含量的动态范围达1012,限制了质谱对低丰度蛋白的有效检测。本实验首先对血清蛋白质进行了预分离处理,去除了高丰度蛋白,从而使低丰度蛋白质得以富集,降低高丰度蛋白质N-糖链对低丰度蛋白质N-糖链鉴定的干扰。然后采用PNGaseF将N-糖链从糖蛋白上去除,然后应用本研究合成的新型衍生化试剂对N-糖链混合物进行衍生化和质谱分析。
　　结果表明,采用新型衍生化试剂衍生后,较经典的试剂INH在MALDI-TOFMS检测中多鉴定到近10种糖链组成,51种糖型。三种试剂共鉴定到血清蛋白质的81种糖链组成,137种糖型。本实验策略较经典的荧光标签8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐(APTS)标记血清N-糖链所检测到117个糖型多鉴定了20个糖型。证明本研究发展的策略有效提高了N-糖链的质谱鉴定数目,为寻找疾病的糖类生物标志物奠定了技术基础。
　　综上,本研究首先通过对商品化糖链衍生化试剂的评价,发现碱性和疏水性的提高,以及电荷的引入有助于提高糖链在质谱中的检测灵敏度。采用筛选出的两种芳稠环的衍生化试剂EB和PBH,评价了其对糖链衍生化后一级和二级质谱行为的改善,发现其能有效地提高糖链在质谱中的检测信号,并将其应用于中性和酸性糖链的质谱分析中,发现两种试剂的引入均能提高糖链的鉴定数目,而且带有阳离子的EB对含有唾液酸结构的糖链质谱行为改善显著。在此基础上,设计合成了两种全新的衍生化试剂TPP-PrG和BRh,评价了其对糖链质谱检测灵敏度的影响,发现其能有效地提高糖链在一级和二级质谱中的检测信号,其中一级质谱检测信号提高了分别为70和35倍,将该策略应用于健康人血清糖链的质谱分析,分别鉴定到了52种糖链组成,92个糖型和51种糖链组成,95个糖型。三种衍生化试剂共鉴定到了81种糖链组成,137个糖型,表明了新型衍生化试剂在复杂生物样品糖链结构和低丰度糖链鉴别中的应用潜力。

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缩略词表

第一章 前言

1.1蛋白质糖基化修饰的意义

1.2蛋白质糖基化修饰的类型

1.3糖蛋白中糖型的研究策略

1.4 总结与展望

第二章 商品衍生化试剂的筛选

2.1引言

2.2 材料和方法

2.4结论

第三章 新型衍生化试剂的合成

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.4本章小结

第四章 衍生化试剂在复杂体系N-糖链分析中的应用

4.1前言

4.2材料与方法4.2.1主要试剂

4.4 本章小结

参考文献

附录

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