I.PMP柱前衍生化法测定N-乙酰-D-甘露糖胺和N-乙酰-D-葡萄糖胺、II.葡萄糖胺2-异构酶的克隆、表达和活性测定

摘要

神经氨酸酶是存在于A、B 型流感病毒表面的糖蛋白，在流感病毒复制和感染过程中起关键酶的作用。神经氨酸酶能催化裂解宿主细胞表面受体末端的神经氨酸残基与糖蛋白、糖脂和寡聚糖之间的α-糖苷键，从而促进新形成的病毒粒子从宿主细胞表面释放，进而从感染的呼吸道黏膜向周围组织扩散；它能够阻止病毒从宿主细胞释放后的凝聚；它可通过裂解呼吸道黏膜中的唾液酸，阻止病毒灭活，促进病毒渗入呼吸道上皮细胞；它还在能刺激炎症细胞因子的产生，从而增强流感感染的症状和呼吸道炎症反应。因此，神经氨酸酶成为抗流感病毒药物研究中很有吸引力的靶点。
　　 国际上一些大型医药公司纷纷从这个靶点出发，研制神经氨酸酶抑制剂类药物。到目前为止，获得FDA 批准上市的神经氨酸酶抑制剂药物有两种：GSK 公司的Zanamivir和Roche 公司的Oseltamivir。
　　 此外，还有一些神经氨酸酶抑制剂类抗流感病毒药物正处于开发研究中。
　　 N-乙酰-D-神经氨酸（Neu5Ac）是合成各类神经氨酸酶抑制剂药物的重要原料，而作为生产Neu5Ac 重要原料的N-乙酰-D-甘露糖胺（ManNAc），目前国内对它的研究报道还很少。它是N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)的同分异构体，在GlcNAc 2-异构酶的作用下,它能和GlcNAc 发生相互转化。由于ManNAc 相对于GlcNAc来说，价钱要贵得很多，如果能提高GlcNAc 2-异构酶的活性，将能大量产生ManNAc 作为生产Neu5Ac的原料，从而大大节约生产Neu5Ac的成本。
　　 同源搜索发现，肠道细菌-多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicronVPI-5482）BT0453位置的基因和猪源异构酶有着41％的同源性。基因工程构建质粒pLS125，利用它表达的蛋白His BT0453。经实验证明，His BT0453 蛋白具有GlcNAc 2-异构酶的活性，能够催化GlcNAc和ManNAc的相互转化。
　　 对GlcNAc和ManNAc的检测和定量有两种方法，一种是采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化高效液相色谱测定；另一种是利用Aminex87H 酸性柱子，通过高效液相色谱测定。对Neu5Ac的检测和定量也有两种方法，一种是利用Aminex87H 酸性糖基柱，通过高效液相色谱测定；另一种是硫代巴比妥酸（TBA）法测定。本研究对这些方法进行了实验。在PMP 柱前衍生化测定GlcNAc和ManNAc的方法中，两者HPLC 分析的均位于5.0 ～1,000pmol，它们的最低检测限均为1.0 pmol；在Aminex-87H 酸性柱测定GlcNAc、ManNAc和Neu5Ac的方法中，三者的HPLC 分析的均位于1.0～100nmol，它们的最低检测限均为1.0nmol；在用TBA 法测定Neu5Ac的方法中，分析范围为1.0～50nmol，最低检测限为1nmol。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:名词简写

声明

第1章 综述

第2章 GlcNAc 、ManNAc 和Neu5Ac 的检测

第三章 异构酶

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致 谢