DNA测序与线性反向探针杂交法检测HBVP基因耐药相关性突变的研究

摘要

乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）感染发病率高，严重危害人们的生命健康。全世界乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性者约3.5亿，我国约有1.2亿，其中3000万为慢性乙型肝炎（chronichepatitisB,CHB）患者。据统计，全球每年约有80万人死于HBV慢性感染所引发的重型肝炎、肝硬化和肝细胞癌等相关疾病。因此防治HBV感染对提高人们的健康水平具有重要意义。
　　抗病毒治疗是临床上治疗慢性乙型肝炎的主要措施。核苷/酸类药物因其用药方便、副作用少、能迅速抑制HBV复制等优点得到广泛应用。临床上应用的此类药物主要有拉米夫定（LAM）、阿德福韦酯（ADV）、替比夫定（LdT）、恩替卡韦（ETV）等，但随着用药时间的延长，出现HBV耐药相关性变异的机率越来越高，并随之出现HBV-DNA反跳、肝功能恶化，因此耐药已成为抗HBV治疗中迫切需要解决的问题。实验研究发现，HBV在人体免疫压力和药物作用下易发生变异，加之HBV逆转录酶（reversetranscriptase,RT）区不具备校正功能，更加剧了HBV的突变，使病毒持续存在和不断复制，导致病情进展。近年来，国内外学者进行了大量探索，尽管建立了多种检测HBV耐药相关性基因变异的方法，但各有其特点和局限性，因此建立一种具有较高特异性和灵敏性且操作简便的方法对于国内临床抗HBV治疗具有重要的现实意义。
　　本研究旨在建立和优化扩增慢性乙型肝炎患者血清标本中HBVP基因的聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）方法，比较DNA序列测定与线性反向探针杂交法（INNO-LiPA试剂）检测HBV基因突变的结果，以期为指导临床制定合理的个体化治疗方案提供重要手段。
　　93例研究对象均系慢性乙型肝炎患者，男77例，女16例，年龄16～66岁；HBsAg阳性均超过6个月；既往接受核苷/酸类药物治疗至少6个月。所有患者治疗期间均出现可疑耐药的情况，或者血清HBV-DNA不同程度下降后又出现反弹，或者HBVDNA自最低值上升＞1log10copies/mL，并伴或不伴有ALT升高。以上研究均获得患者的知情同意。
　　研究的内容和实验结果如下：
　　1.HBV血生化指标
　　抽取使用核苷/酸类药物不同阶段慢性乙型肝炎患者的外周血，常规检测HBV-DNA、ALT和TBiL等血生化指标。发现不同时间点患者的HBV-DNA和ALT与治疗前相比均明显降低（P＜0.05），但是LAM组和联合用药组的HBV-DNA在治疗13～24月阶段比7～12月阶段明显升高(P＜0.05)。TBiL变化无统计学意义。
　　2.扩增HBV-DNAP基因逆转录酶片段巢式PCR方法的建立
　　根据GenBank收录的HBVadr亚型基因全序列（GI:329616）。采用Oligo6.67软件辅助分析，设计巢式PCR引物，通过反复试验，筛选出有较好序列兼容性及较高反应效率的外引物和内引物，目的片段大小为725bp，包括RT区A、B、C、D、E亚区。用不同病毒载量的患者血清提取出的HBV-DNA作为模板，反复试验，优化巢式PCR反应条件，用2％琼脂糖凝胶电泳检测。
　　3.DNA序列测定
　　取PCR产物进行序列测定（由上海Invitrogen生物技术有限公司完成），成功测序86份，其中含2例血清标本中的HBV-DNA＜1×103copies/mL者。进一步用SeqmanTMⅡ、EditSeqTM和MegAlign软件进行分析,共检测到突变位点113个。除已知确定的相关耐药位点外，还检测到V84I、S85C、A181S、L229W、N238H、N238A和N238T等突变位点。
　　4.线性探针反向杂交法的检测
　　随机抽取40例患者的血清标本，用线性反向探针杂交法（INNO-LiPAHBVDRv3）检测已知的11个耐药位点，即HBV-DNA聚合酶的第80、173、180、181、184、194、202、204、233、236和250位氨基酸。经扩增、杂交、洗脱、显色后在检测条带上呈紫/棕色沉淀物。在40份血清标本中检出了以下突变形式：10例L180M+M204V,1例V173L+L180M+M204V，7例M204I,另有L80I+M204I、L80I、L80V、A181T、A181V和N236T各1例。仅5例与DNA测序结果不一致。
　　结论：
　　1.核苷/酸类药物长期使用可导致耐药，多出现在治疗12个月以后。
　　2.建立在巢式PCR基础上的DNA序列测定法，其敏感性与INNO-LiPA相当，检测结果与INNO-LiPA试剂有较高符合率，并可检出更多的耐药相关突变，提供更全面的信息，且价格相对便宜，更加适合现实的中国国情。

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缩略语表

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前 言

文献回顾

1 乙型肝炎病毒的生物学特性和流行现状

2 核苷/酸类似物（nucleoside/ nucleotide analogues,NA）抑制HBV 复制的机制

3 HBV 的耐药变异

4 HBV 耐药对临床结局的影响

5 HBV 基因耐药检测方法

6 对 HBV 耐药的临床应对措施

正 文

实验一 HBV-DNA P 区逆转录酶片段扩增及序列测定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 线性反向探针杂交法检测HBV-DNA P 区耐药变异

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小 结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢