GLP-1受体介导脑缺血保护作用的记忆效应及机理研究

摘要

研究目的：
　　缺血性脑卒中是严重威胁人类健康的重大疾病，具有发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高的特点，其致死率与心血管疾病及恶性肿瘤并称为影响人类健康的三大杀手。目前唯一被美国FDA批准治疗脑卒中的药物是组织型纤溶酶原激活剂（Tissue plasminogen activator，tPA），由静脉注射进行溶栓治疗。尽管实现血管再通，恢复脑血流灌注是脑卒中急性期最直接有效的治疗手段，但由于该药必须在脑卒中发生后短时间内用药，用药时机受限，同时又具有造成继发性出血的风险，一定程度上限制了该药溶栓治疗的临床应用。因此寻找和发现防治缺血性脑卒中的新靶标，以及具有长效脑保护作用的新药物依然是脑缺血损伤防治领域的研究重点和目标。
　　胰高血糖素样肽-1（Glucagon-like peptide-1，GLP-1）受体是一类广泛分布于机体外周和中枢多种器官的G蛋白偶联受体（G protein coupled receptor，GPCR），由肠道及其他器官分泌的GLP-1是该受体的天然激动剂。该受体激动后，参与调控胰岛素分泌、胰岛细胞增殖、胃肠道运动、以及心血管和神经系统的保护作用。由于激动GLP-1受体能够显著促进血糖依赖性胰岛素分泌，降低血糖，因此选择性GLP-1受体激动剂艾塞那肽（Exenatide，exendin-4）、利拉鲁肽（Liraglutide）等已被临床用于糖尿病的治疗。我们和其他学者在前期的研究中发现，GLP-1受体激动剂的降血糖效应，在停止给与药物后依然能够持续数天之久。我们在研究GLP-1受体激动剂对缺血性脑损伤保护作用时，首次发现给予小鼠脑内注射GLP-1受体激动剂exendin-4后，其脑保护作用在停药数天后依然可维持数天，我们将该效应定义为GLP-1受体激动剂的保护性“记忆效应”。然而，目前对于该“记忆效应”的作用规律和分子机理完全不清楚。本课题针对这一新发现的现象展开系统和深入的研究，旨在揭示GLP-1受体介导脑保护“记忆效应”的作用规律，发现其信号调控分子，揭示其信号调控通路和调控机理，为缺血性脑损伤的防治发现干预新靶标，探索治疗新策略，提供药物研发新信息。
　　研究方法：
　　1. GLP-1受体激动剂exendin-4抑制脑缺血损伤记忆效应的规律
　　C57BL/6J小鼠，腹腔注射GLP-1受体激动剂exendin-4(5μg/kg)，1次/日，连续7天，分别在停药后第0、2、4、6、8、10天行大脑中动脉栓塞术（middle cerebral artery occlusion，MCAO），制备脑缺血/再灌注损伤模型，即缺血1 h，再灌注24 h。于再灌注后第24 h对实验动物进行神经缺陷评分，然后取全脑，切片，氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色，计算脑组织梗死体积。根据神经缺陷评分和脑梗死体积评价exendin-4对缺血脑组织保护性记忆效应的持续时间与作用强度。
　　2.脑内GLP-1受体参与介导记忆保护效应
　　C57BL/6J小鼠，腹腔注射exendin-4(5μg/kg)，1次/日，连续7天，分别在停药后第0、2、4、6、8、10天取血和全脑，酶免疫分析（EIA）法检测血浆和脑组织中exendin-4的浓度，评价血中和脑内exendin-4浓度与记忆效应的相关性。
　　C57BL/6J小鼠，腹腔注射exendin-4(5μg/kg)后0、30、60、90、120 min尾静脉取血，全自动血糖仪测定血糖值，ELISA试剂盒测定血浆胰岛素水平，评价血糖和血胰岛素浓度与记忆效应的相关性。
　　C57BL/6J小鼠，脑内缺血半暗区定向注射慢病毒包装的shRNA，用于沉默GLP-1受体，于注射后第0、1、3、7、14、21天取脑组织，RT-PCR法和Western blot法检测GLP-1受体的表达，评价GLP-1受体沉默的效果。
　　C57BL/6J小鼠脑内注射 shRNA后第7天，腹腔给予 exendin-4(5μg/kg)，1次/日，连续7天，停药后第0天和第7天，分别行MCAO术制备脑缺血/再灌注损伤模型，于再灌注后第24 h，进行神经缺陷评分；然后取脑组织，切片，TTC染色，计算脑组织梗死体积，评价沉默GLP-1受体后对exendin-4介导记忆效应的影响。
　　3. GLP-1受体介导记忆效应的信号分子
　　培养原代小鼠皮层神经元细胞7天，向神经细胞培养液中加入exendin-4（1μM）处理2 h，然后制备氧糖剥夺/复氧（Oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）模型模拟缺血/再灌注损伤，采用 ELISA试剂盒检测神经细胞内 cAMP水平，Western-blot方法检测PKA、PI3K和AKT的表达，以及p-PI3K、p-AKT的磷酸化水平；并采用MTT法检测给予PKA抑制剂H-89、PI3K抑制剂Wortmanin预处理后神经细胞的活力，乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）漏出法检测细胞损伤程度，Hoechst/PI双染检测细胞凋亡程度，评价 cAMP-PKA、PI3K-AKT信号通路在exendin-4所介导的神经保护效应中的作用。
　　C57BL/6J小鼠，腹腔注射exendin-4（5μg/kg），1次/日，连续7天，停药后第6天制备MCAO模型，再灌注24h后，取缺血半暗区脑组织，检测脑组织中PKA、PI3K和AKT的表达，以及p-PI3K、p-AKT、p70S6、hif-1α活化的程度；小鼠脑内定向注射hif-1αshRNA，依据前述方法给予exendin-4，制备MCAO模型，然后观察沉默hif-1α后，受其调控的下游信号分子GLUT1、GLUT3、EPO、VEGF、caspase-3等信号分子的变化，以及对exendin-4脑保护效应的影响，探讨与GLP-1受体介导记忆效应相关的信号分子。
　　4. GLP-1受体介导的记忆效应可能的信号调控通路
　　C57BL/6J小鼠，依据前述方法给予 exendin-47天，停药第6天，取脑组织，Western blot法检测IGF-1受体的表达；按照同样方法给予小鼠exendin-47天，停药第6天，行MCAO术制备脑缺血模型，于再灌注第1 h,采用Western blot法检测缺血脑组织中IGF-1和IGF-1受体的表达，以及 IGF-1受体磷酸化水平，并与再灌注24 h后进行神经缺陷评分，TTC染色，计算脑梗死体积；并观察阻断IGF-1受体后对exendin-4记忆效应的影响，探讨GLP-1受体介导的记忆效应与IGF-1受体信号通路的相关性。
　　研究结果：
　　1. Exendin-4诱导保护脑缺血损伤记忆效应的规律
　　连续7天给予小鼠选择性GLP-1受体激动剂exendin-4(5μg/kg)预处理，然后在停药后不同时间制备脑缺血/再灌注损伤模型，结果发现在exendin-4停药后第2、4、6天，脑缺血/再灌注损伤所致的神经缺陷评分均显著降低，脑梗死体积显著减小，该保护效应在停药后第8天消失。分别给予小鼠1天或连续3天exendin-4预处理，则未观察到明显的记忆保护效应。表明在5μg/kg剂量预处理7天条件下，exendin-4可以介导一个持续6天的脑保护效应，我们将该效应定义为脑保护的“记忆效应”。阳性对照药物尼莫地平停药后未观察到保护性记忆效应。Exendin-4介导的脑保护记忆效应呈现剂量依赖性，分别给予小鼠2.5μg/kg、5.0μg/kg和10.0μg/kg三个剂量exendin-4预处理7天，观察停药后第6天的脑缺血/再灌注损伤的程度，结果显示，无论是神经缺陷评分和脑梗死体积，均呈现剂量依赖性降低和减小。
　　2.脑内GLP-1受体参与介导了记忆效应
　　由于 exendin-4具有显著地促进胰岛素分泌和降低血糖的作用，为了明确exendin-4介导的记忆效应是否与胰岛素和血糖浓度变化相关，我们检测了小鼠血浆胰岛素和血糖浓度。结果显示，小鼠腹腔分别注射2.5μg/kg、5.0μg/kg和10.0μg/kg剂量的 exendin-4后，其血浆内胰岛素和血糖浓度与给药前相比无显著变化，提示exendin-4介导的记忆效应与血糖和胰岛素无关。
　　Exendin-4介导的记忆效应是否与其体内药物浓度相关，我们检测了连续给药7天后小鼠血内和脑内exendin-4的浓度。结果显示exendin-4在最后一次给药后1 h，血中药浓度和脑内药物浓度达峰值，随后血内和脑内药物浓度迅速降低，用药后8、16、24 h，以及第2、4、6天，均未在血内和脑内检测出exendin-4，提示exendin-4介导的记忆效应与体内exendin-4浓度无关。
　　那么，exendin-4介导的效应是否与GLP-1受体相关，我们进一步采用基因沉默策略，以慢病毒为载体，定向向脑内递送shRNA，观察GLP-1受体沉默后对exendin-4介导的记忆效应的影响。结果显示，采用shRNA沉默GLP-1受体后，exendin-4介导的改善神经缺陷评分和缩小脑梗死体积保护性记忆效应完全消失，提示GLP-1受体参与介导了对缺血脑的保护性记忆效应。
　　3. GLP-1受体参与介导记忆效应的信号分子
　　GLP-1受体主要通过cAMP-PKA通路和PI3K-AKT信号通路调控机体的各种效应。为了明确GLP-1受体通过何种信号分子参与介导记忆效应，我们观察了exendin-4对上述两条信号通路中信号分子的影响。我们在原代培养神经细胞上观察到，exendin-4既可以增加正常和ODG损伤神经细胞内cAMP、PKA的含量，也可以增加上述细胞内p-PI3K、p-AKT的含量，上述效应均可以被GLP-1受体拮抗剂所阻断。exendin-4抑制OGD所致神经细胞损伤作用能够被PKA抑制剂或PI3K抑制剂所阻断，提示 exendin-4通过启动正常培养和急性 OGD损伤神经细胞内 cAMP-PKA和PI3K-AKT信号通路中信号分子的功能，发挥细胞保护作用。
　　然而，整体动物的实验结果则显示，exendin-4停药后，MCAO模型动物脑缺血半暗区cAMP和PKA的含量，以及下游调控分子p-CREB与对照组相比无显著变化，但是p-PI3K和p-AKT的含量，及其下游信号分子p-mTOR和hif-1α的含量显著升高，采用shRNA策略沉默hif-1α基因后，exendin-4的保护性记忆效应被取消。提示PI3K-AKT-mTOR-hif-1α信号通路参与GLP-1受体介导的记忆效应，cAMP-PKA-CREB信号通路则不参与GLP-1受体介导的记忆效应。
　　在小鼠体内进一步研究发现，exendin-4预处理7天，停药6天进行MCAO所致脑损伤，受HIF-1调控的下游基因glut1、glut3、epo和vegf均显著上调，沉默hif-1α基因后，exendin-4上调上述基因的作用被取消。同时检测缺血半暗区内凋亡相关蛋白caspase-3，exendin-4可显著降低其表达，并显著减少神经细胞凋亡的数目。提示GLP-1受体介导的记忆效应可能与其抗凋亡作用相关。
　　4. GLP-1受体介导的记忆效应可能的信号调控通路
　　我们的研究发现，当连续7天给予exendin-4，停药后第6天，脑内cAMP-PKA、PI3K-AKT信号通路中的信号分子含量，均降低至正常对照组水平。然而，当给停药后第6天小鼠实施MCAO缺血损伤后，脑内PI3K-AKT信号通路被激活。为了探讨激活该信号通路的机理，我们进行了深入观察。结果发现，在exendin-4预处理7天，停药6天小鼠缺血半暗区内内IGF-1受体的表达显著增加，进一步观察发现exendin-4诱导的IGF-1受体高表达小鼠，在进行MCAO损伤后，其脑内活化的IGF-1受体明显增多，同时由IGF-1受体调控的下游信号分子p-AKT、hif-1α显著增多，阻断IGF-1受体可以完全取消exendin-4引起的脑保护记忆效应。提示GLP-1受体可能通过上调IGF-1受体表达，启动IGF-1受体调控的PI3K-AKT-mTOR-hif-1α信号通路，最终发挥脑保护记忆效应。
　　结论：
　　1. GLP-1受体激动剂exendin-4给予小鼠预处理7天后，可诱导产生长达6天的抑制脑缺血/再灌注损伤的持续效应，我们将该效应定义为记忆效应，该效应由脑内GLP-1受体介导。
　　2. GLP-1受体介导的记忆效应与激活神经细胞内PI3K-AKT-mTOR-hif-1α信号通路相关，与GLP-1受体经典的cAMP-PKA信号通路无关。
　　3. GLP-1受体通过上调神经细胞上的 IGF-1受体，启动 IGF-1受体调控的PI3K-AKT-mTOR-hif-1α信号通路，发挥脑保护的记忆效应。

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缩略语表

中文摘要

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前言

文献回顾

一、脑缺血卒中

二、 GLP-1受体

三、PI3K-AKT-mTOR信号通路

四、低氧诱导因子-1（HIF-1）与脑缺血

第一部分 激动GLP-1受体对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用具有记忆效应

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第二部分 脑内GLP-1受体参与介导脑缺血再灌注损伤保护作用的记忆效应

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第三部分 脑内GLP-1受体通过PI3K-AKT-mTOR通路介导神经保护记忆效应

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第四部分 HIF-1参与调控GLP-1受体介导的记忆效应

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第五部分 GLP-1受体通过上调IGF-1R启动记忆效应

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

总结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢