利用T7噬菌体cDNA文库筛选登革2型病毒与白纹伊蚊相互作用基因

摘要

目的：
　　 1.从白纹伊蚊体内提取总RNA，分离纯化出mRNA，反转录成双链cDNA并将其转入T7噬菌体，利用T7噬菌体构建白纹伊蚊cDNA文库，并鉴定文库是否符合文库构建标准。
　　 2.培养C6/36细胞，利用C6/36细胞扩增登革2型病毒，并将登革2型病毒进行纯化，测量病毒滴度，检测纯化后病毒与登革2型特异性抗体的结合能力。
　　 3.利用上述构建的白纹伊蚊T7噬菌体cDNA文库与分离纯化的登革2型病毒，通过蛋白分子杂交的方法，筛选出白纹伊蚊与登革2型病毒相互作用的相关因子的基因，并将筛选出的基因进行生物信息学分析。
　　 方法：
　　 1.利用T7噬菌体构建白纹伊蚊cDNA文库：首先分离纯化出白纹伊蚊的mRNA;所得的mRNA经反转录合成双链cDNA，在双链cDNA末端加上定向的EcoRⅠ/HindⅢ接头使其两端分别带EcoRⅠ和HindⅢ黏性末端；然后用MiniColumn纯化收集300bp以上的双链cDNA片段，连接于T7Select10-3b载体；经体外包装后，以BLT5403为受主菌株构建T7噬菌体展示cDNA文库。对从原始文库中随机挑取的50个噬菌斑进行PCR鉴定重组率。将构建成功的cDNA文库进行扩增，浓缩并保存。
　　 2.纯化登革2型病毒：采用登革2型病毒的中间受主C6/36细胞来增殖病毒。通过分析登革2型病毒对C6/36细胞感染和复制的情况，确定收获高滴度病毒的最佳时间段，然后通过大量的感染来增殖病毒。获得大量登革2型病毒液，然后反复冻融，使增殖的登革病毒从感染的C6/36细胞中释放出来。采用PEG-8000进行浓缩，将浓缩病毒重悬，用30％的蔗糖垫底进行超速离心，将病毒纯化。将纯化的病毒进行滴度测试和病毒感染性检测。
　　 3.筛选与登革2型病毒相互作用的白纹伊蚊作用因子：应用噬菌体展示技术。以纯化的登革2型病毒作为靶分子，通过蛋白分子杂交的方法，对T7噬菌体白纹伊蚊cDNA文库进行多轮生物筛选，对筛选到的阳性克隆进行测序，将测序得到的DNA序列进行分析及同源性搜索
　　 结果：
　　 1.本文所构建的白纹伊蚊cDNA文库在重组率、文库库容量和文库的均一性方面均符合文库构建的基本要求。此文库的库容量经测定为1.7×107pfu/mL，扩增后文库滴度为2.5×1013pfu/mL，浓缩后的文库滴度为2.13×1015pfu/mL。重组率为95％以上；阳性克隆片段长度分布在200bp至2000bp，其中有90％的插入片段大于300bp。均符合构建文库的库容量在1.0×106以上，构建文库的库容量在90％以上且大于300bp，文库的均一的标准。本文成功构建的白纹伊蚊cDNA文库，为后续的虫媒病毒相关受体的研究提供了充足的材料。
　　 2.C6/36细胞在感染病毒5天后出现细胞皱缩、变形，继而出现多细胞融合形成的巨细胞，7-8天左右出现大量细胞破碎。在细胞发生融合时，将其于-20℃冻存。获得大量的登革病毒液后，将所得的病毒液纯化，纯化后的登革2型病毒的滴度为TCID50=10-3.875。纯化的登革2型病毒通过SDS-PAGE分析，加入登革一抗可以看到明显的条带。所得到的登革2型纯化病毒的滴度和SDS-PAGE的结果分析均表示其具有很强的感染能力，这可以为相关实验提供足够感染能力的病毒。
　　 3.通过将所构建的白纹伊蚊cDNA文库和所纯化的登革2型病毒相互作用，多次淘洗得到2个阳性克隆。将其测序后，其测序结果在NCBI的EST数据库中进行同源性搜索和比对(BLAST)，发现这两个阳性克隆分别与埃及伊蚊的唾液腺上的基因序列和埃及伊蚊的mRNA降解蛋白质的部分基因的序列具有很高的同源性，同源性分别达到81％和90％。因埃及伊蚊与白纹伊蚊的同源性很高，同为传播登革病毒的重要蚊虫媒介。因此，此结果可以确定是能与登革2型病毒相互作用的蛋白，其中一段基因位于蚊虫唾液腺上，这与许多研究蚊虫登革病毒受体的工作人员得到的结果一致，但是重新从分子生物学的角度得到了有力证据，以前的研究大部分停留在蛋白的阶段。同时也发现mRNA降解蛋白质(NMD)与白纹伊蚊感染传播登革2型病毒有可能存在一定的关系。
　　 结论：
　　 1.本文构建了白纹伊蚊T7噬菌体展示cDNA文库，构建的文库满足生物分子学文库的基本标准，可以用于筛选白纹伊蚊与相关蚊虫病毒相互作用基因的研究。同时，为后续研究白纹伊蚊与登革病毒相互作用机制和蚊虫传播虫媒病毒的相关研究奠定了基础，提供了充足的研究材料。而且从分子生物学的角度来看，这对虫媒病毒的传播有了更深刻地研究。
　　 2.本文用此方法纯化的登革2型病毒的滴度符合后续筛选要求,将纯化的登革2型病毒进行病毒滴度测试，此病毒滴度的登革2型病毒的感染力基本符合要求；通过用SDS-PAGE的方法分析此方法纯化的登革2型病毒，可以看到在目的条带处有明显的条带，说明所纯化的登革2型病毒具有感染力。
　　 3.本文使用的T7噬菌体展示技术是筛选相互作用因子基因的一种简单、快速和有效的手段。筛选到的相互作用因子的基因为进一步探讨白纹伊蚊与登革2型病毒感染机制提供了重要的依据；对媒介蚊虫对登革病毒易感性机制和掌握登革热流行的特点及制定媒介控制措施有着重要的意义。许多文献表明在白纹伊蚊体内存在着登革病毒受体，其可能分布在唾液腺，中肠，卵巢等不同部位。本文筛选到了唾液腺相关的基因，为以前的研究提供了更有理的证据，同时发现了白纹伊蚊感染传播登革2型病毒可能与mRNA降解蛋白质有关，将会为白纹伊蚊感染传播登革病毒分子机制的研究找到一个新的突破口。

目录

证明

缩略词

第一部分：利用T7噬菌体构建白纹伊蚊cDNA文库

1．1 材料与方法

1．2 结果

1．3 讨论

1．4 参考文献

第二部分：登革2型病毒繁殖与纯化

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 参考文献

第三部分：筛选与登革2型病毒相互作用因子的基因

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 参考文献

综述

附录

个人简历

致谢