副溶血弧菌丝氨酸蛋白酶及溶血素的表达、纯化、定点突变及弧菌多联DNA疫苗的研制

摘要

弧菌病是海水养殖动物最严重的细菌性病害之一,其中副溶血弧菌是鱼虾贝类的主要弧菌病原,也是人类食物中毒的主要病原菌。
　　 从致病性副溶血弧菌FYZ8621.4基因组中克隆了丝氨酸蛋白酶基因(vps)。其由1779 bp组成,编码含592个氨基酸的多肽,连接到pET-28a(+)中构建表达质粒pET-28a(+)/vps,并在夫肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。表达的丝氨酸蛋白酶经Ni琼脂糖亲和柱纯化后,SDS-PAGE分析其分子量为63 kDa。酶的最适pH为8.0,最适反应温度为37℃。利用PCR方法对丝氨酸蛋白酶催化三联体氨基酸进行定点突变(Asp51-Asn,His89-Asp,Ser318-Ala,Ser318-Leu,Ser318-Pro),结果突变蛋白全部或部分的丧失了蛋白酶活性。将丝氨酸蛋白酶的突变基因vps(Ser318-Pro)与真核表达载体pEGFP-N1连接,构建DNA疫苗pEGFP-N1/m-vps。分别用10μg和50μg的pEGFP-N1/m-vps对大菱鲆进行肌肉注射免疫,免疫1周后能在鱼的肌肉组织检测到外源蛋白的表达,并在鱼的血清中检测到特异性抗体,4周后的抗体效价分别为1:512和1:1,024。DNA疫苗对大菱鲆的免疫保护率分别为80.55％和96.11％,具有显著保护作用(P＜0.05)。
　　 从副溶血弧菌FYZ8621.4基因组中克隆了热稳定直接溶血素TDH2单体的基因(tdh2)。其由570bp组成,编码含189个氨基酸的多肽,连接到pET-28a(+)中构建重组质粒pET-28a(+)/tdh2,并在BL21(DE3)中表达。表达的TDH2经Ni柱纯化后,SDS-PAGE分析其分子量为21 kDa。利用PCR方法对tdh2中与溶血作用相关的两个氨基酸进行定点突变(Gly62-Ser,Trp65-Ala),突变的蛋白完全丧失了溶血活性。将热稳定直接溶血素的突变基因tdh2(Trp65-Ala)与pEGFP-N1连接,构建DNA疫苗pEGFP-N1/m-tdh2。分别用10μg和50μg的pEGFP-N1/m-tdh2对大菱鲆进行肌肉注射免疫,免疫1周后在鱼的肌肉组织检测到外源蛋白的表达,并在鱼的血清中检测到特异性抗体,4周后抗体效价分别为1:4,096和1:8,192。DNA疫苗对大菱鲆的免疫保护率分别为92.22％和100％(P＜0.05)。
　　 将副溶血弧菌的tdh2基因和vps基因先后连接到原核表达载体pET-28a(+)中构建融合基因tdh2-vps。重组质粒pET-28a(+)/tdh2-vps在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。表达的融合蛋白TDH2-VPS经Ni柱纯化后,SDS-PAGE分析其分子量为85 kDa。将融合基因tdh2-vps与pEGFP-N1进行连接,构建二价DNA疫苗pEGFP-N1/tdh2-vps。分别用10μg和50μg的pEGFP-N1/tdh2-vsp对大菱鲆进行肌肉注射免疫,免疫1周后能在鱼的肌肉组织检测到外源蛋白的表达,并在鱼的血清中检测到特异性抗体,4周后抗体效价分别为1:1,024和1:2,048。DNA疫苗对大菱鲆的免疫保护率分别为96.11％和100％(P＜0.05)。
　　 将副溶血弧菌tdh2基因和哈维氏弧菌oppA基因连接到pET-28a(+)构建融合基因tdh2-oppA。重组质粒pET-28a(+)/tdh2-oppA在BL21(DE3)中表达。表达的融合蛋白TDH2-OppA经Ni柱纯化后,SDS-PAGE分析其分子量为84 kDa。将融合基因tdh2-oppA与pEGFP-N1进行连接,构建二联DNA疫苗pEGFP-N1/tdh2-oppA。分别用10μg和50μg的pEGFP-N1/tdh2-oppA对大菱鲆进行肌肉注射免疫,免疫1周后在鱼的肌肉组织检测到外源蛋白的表达,并在鱼的血清中检测到特异性抗体,4周后抗体效价分别为1:512和1:2,048。DNA疫苗对副溶血弧菌感染大菱鲆的免疫保护率均为100％;对哈维氏弧菌感染大菱鲆的免疫保护率分别为40％和60％(P＜0.05)。
　　 将副溶血弧菌tdh2基因和鳗弧菌ompU基因连接到pET-28a(+)中构建融合基因tdh2-ompU。重组质粒pET-28a(+)/tdh2-ompU在BL21(DE3)中麦达。表达的融合蛋白TDH2-OmpU经Ni柱纯化后,SDS-PAGE分析其分子量为57 kDa。将融合基因tdh2-oppA与pEGFP-N1进行连接,构建二联DNA疫苗pEGFP-N1/tdh2-ompU。分别用10μg和50μg的pEGFP-N1/tdh2-ompU对大菱鲆进行肌肉注射免疫,免疫1周后在鱼的肌肉组织检测到外源蛋白的表达,并在鱼的血清中检测到特异性抗体,4周后抗体效价分别为1:1,024和1:2,048。DNA疫苗对副溶血弧菌感染大菱鲆的免疫保护率均为100％;对哈维氏弧菌感染大菱鲆的免疫保护率分别为15％和35％(P＜0.05)。