副溶血弧菌耐热直接溶血素基因的克隆与表达

摘要

应用PCR技术从副溶血弧菌wVp2株扩增了tdh基因,将tdh基因经BamHI、EcoRI双酶切后定向插入pGEX-4T-1表达载体,测序分析结果表明所克隆的tdh基因与tdh1基因(GenebankM10069)的同源率达99.82﹪,开放阅读框(ORF)为570nt,编码由189个氨基酸组成、分子量为23kDa的耐热直接溶血素.转化pGEX-4T-1-tdh的大肠杆菌BL21(DE)经IPTG诱导后,在迁移率为49kD位置上出现一条明显的蛋白带,该融合蛋白的表达量占菌体总蛋白含量的32﹪.收集菌体裂解上清,通过GlutathioneSephrose4B亲和柱层析和Thrombin酶切获得纯化的TDH.免疫学分析证实纯化的表达产物能被副溶血弧菌胞外产物的特异性抗血清所识别,当抗血清稀释度为1:1000时,能检出TDH蛋白量为31.25ng.副溶血弧菌的tdh基因克隆与表达,为在单因子水平上研究副溶血弧菌TDH的毒力、致病机理以及诱导宿主免疫应答方面的作用奠定基础.