松材线虫tra-1基因克隆及功能分析

摘要

松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）是重要外来入侵有害生物，给我国林业产业和生态环境造成重大威胁。高繁殖力是松材线虫重要致病因素，松材线虫雌雄比调节繁殖力。国内外对松材线虫病的研究，主要集中于病原、媒介昆虫、扩散机制、致病机理和防控措施等方面，在其发育生物学和繁殖生物学等方面的研究较少。 性别作为生物长期进化过程中最重要的性状之一，它由性别决定和分化共同作用产生并维持控制，性别决定与性别分化影响个体的生殖能力和种群的性比，与物种的延续有关。tra-1基因是秀丽隐杆线虫性别决定中起重要作用的基因，是性别决定基因级联作用的终端全局调节因子。研究了松材线虫tra-1基因在性别决定中的作用，主要结果如下： （1）首次克隆了松材线虫tra-1基因，该序列总长度为2283bp，编码760个氨基酸，该多肽含有5个连续的C2H2型锌指，属于五锌指蛋白，编码锌指转录因子TRA-1A。其保守结构域、氨基酸序列、蛋白质三级结构域都与秀丽隐杆线虫的tra-1基因有较高的相似性，尤其是锌指结构域相似度更高。 （2）选择松材线虫二龄幼虫进行tra-1基因RNAi，结果表明：松材线虫tra-1-a基因调控成虫的生殖结构的发育，两性生殖系统发育异常，主要表现为雌虫中卵巢、阴门等生殖系统结构畸形，雄虫精巢、交合刺产生畸形。同时发现，松材线虫tra-1基因经RNAi后，松材线虫雌雄比、繁殖力、雌虫繁殖率显著降低，并持续影响到子代。 （3）鉴于tra-1本的基因功能特征，本研究对松材线虫发育特征研究有重要借鉴，为通过发育干扰防控松材线虫病提供了良好的基因资源。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1 松材线虫简介

1.1.1 松材线虫病介绍

1.1.2 松材线虫发育生物学特征

1.2 线虫性别决定

1.2.1 性别决定

1.2.2 线虫生殖系统的差异

1.2.3 秀丽隐杆线虫性别决定遗传途径

1.3 线虫tra-1研究进展

1.3.1 tra -1基因的生物学背景

1.3.2 tra-1基因结构

1.3.3 tra-1基因功能

1.4 试验目的和意义

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 试验虫株

2.1.2 试验菌株

2.1.3 培养基及溶液配制

2.1.4 试验仪器

2.2 试验方法

2.2.1 松材线虫的培养

2.2.2 松材线虫的分离

2.2.3 同步发育线虫的获得

2.2.4 松材线虫 tra-1基因编码区的克隆

2.2.5 松材线虫 tra-1基因生物信息学分析

2.2.6 松材线虫 tra-1基因的重组质粒构建

2.2.7 松材线虫 tra-1基因dsRNA模板制备

2.2.8 松材线虫 tra-1基因RNAi功能验证

3 结果与分析

3.1 松材线虫tra-1 PCR扩增

3.1.1 松材线虫RNA提取结果

3.1.2 松材线虫tra-1-a PCR扩增结果

3.1.3 松材线虫tra-1-b PCR扩增结果

3.1.4 松材线虫tra-1-b重组质粒验证

3.1.5 松材线虫tra-1-b重组质粒验证结果

3.2 松材线虫tra-1 dsRNA合成

3.2.1 松材线虫tra-1-b dsRNA模板合成

3.3.2 松材线虫tra-1-b dsRNA合成

3.2.3 松材线虫tra-1-a dsRNA模板合成

3.2.4 松材线虫tra-1-a dsRNA合成

3.3 松材线虫tra-1生物信息学分析

3.3.1 松材线虫tra-1基因

3.3.2 蛋白结构域同源比对

3.3.3 亚细胞定位分析

3.3.4 松材线虫tra-1-a蛋白质三级结构预测

3.4 松材线虫tra-1-a RNAi试验

3.4.1 tra-1-a基因RNAi后死亡率

3.4.2 tra-1-a基因RNAi后生殖系统的形态观察

3.4.3 tra-1-a基因RNAi后体型测定

3.4.4 松材线虫tra-1-a RNAi试验雌雄比测定

3.4.5 松材线虫tra-1-a RNAi后不同继代繁殖力测定

3.4.6 松材线虫 tra -1-a RNAi 后不同继代雌虫繁殖率测定

3.4.7 tra-1-a RNAi对子代各个龄期所占的比例的影响

4 讨论

4.1 松材线虫tra-1基因的克隆以及分析

4.2 松材线虫tra-1基因RNAi试验

4.3 松材线虫tra-1-a基因的功能验证

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况