松材线虫的早期诊断、快速检测技术及松材线虫与拟松材线虫的差异蛋白质组研究

摘要

松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)是松材线虫病的病原，它是包括我国在内的许多国家重要的林业病害，也是许多国家的重要检疫对象，在我国属于二级检疫对象，每年造成的生态与经济损失难以估计。但是因为它和致病性弱的拟松材线虫(B．mucronatus)在形态上极其相似，在显微镜下难以区分，这给松材线虫的检疫和防治带来了很大的困难。 本研究着眼于对松材线虫的快速检测和早期诊断技术进行改进与完善，建立了适用于松材线虫的口岸检疫、林木防疫与监测的体系与方法；并开展了松材线虫与拟松材线虫的差异蛋白质组研究。 本研究建立了基于快速分离器与分子检测方法的松材线虫快速检测体系，最快可以在90 min内完成从样品分离到得到鉴定结果的全过程，快速灵敏高效，大大缩短了检验检疫所需的时间，适合口岸快速通关的需要；基于松材线虫病早期检测管与Y型等长双链探针—实时荧光PCR快速检测技术的松材线虫病早期诊断体系，可以有效、及早地发现还处于感染早期尚未出现明显病症的松木，有利于及时清除传染源，防止疫情扩散；建立了应用荧光PCR技术检测松墨天牛所携带的线虫情况的体系与方法，因而使在诱捕松墨天牛并调查其所携带线虫情况时所遇到的虫体腐烂而难以鉴定的难题得到解决；首次运用双向电泳与MALDI—TOF—MS/MS蛋白质组学手段，对松材线虫和拟松材线虫的差异蛋白质组进行研究，研究认为两种线虫在代谢途径、信号调控机制和胞质转运机制上都存在着一定差异，支持松材线虫是唯一病原病的理论，并对松材线虫的致病机理进行了初步探讨。该研究也为进一步的松材线虫血清学检测鉴定和致病机理研究打下基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语Abbreviatins

声明

第一章 绪论

1松材线虫检测技术研究进展

1.1松材线虫病概述

1.2松材线虫与近缘种-拟松材线虫的关系

1.3松材线虫的检测技术

2荧光PCR技术

2.1实时荧光PCR的定量分析能力

2.2主要的荧光化学技术

3蛋白质组学技术

3.1差异蛋白质组学

3.2蛋白质组学的分析技术

第二章 基于快速分离器和分子检测方法的松材线虫快速检测体系

1引言

2材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

3结果与分析

3.1松材线虫与拟松材线虫rDNA序列比对

3.2特异引物的设计

3.3荧光PCR检测体系

3.4.常规PCR检测体系

3.5送检松木样品的检测

4讨论

4.1 DNA提取方法的改进

4.2快速检测体系的PCR效率

4.3快速检测体系的特异性

4.4快速检测体系的灵敏性

4.5快速检测体系在实际应用中的效果

4.6荧光PCR快速检测体系的样品定量分析

4.7快速检测体系的应用价值

第三章 应用荧光PCR检测体系监测松墨天牛携带线虫情况的研究

1引言

2材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

3结果与分析

3.1天牛解剖观察

3.2乙醇固定剂对荧光PCR检测的影响

3.3乙醇固定的天牛体内检获线虫的荧光PCR鉴定

4讨论

4.1固定剂选择

4.2固定剂使用方案设计

4.3实际应用及后续工作

第四章基于“早期检测管”与Y型等长双链探针-实时荧光PCR快速检测技术的松材线虫病早期诊断体系

1引言

1.1新型可靠的检测手段

1.2快速灵敏的检测技术

2材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

3结果与分析

3.1松材线虫特异引物及探针的设计

3.2 Y型荧光探针的设计合理性与特异性

3.3 Y型荧光探针检测松材线虫的特异性

3.4 Y型荧光探针的检测灵敏度

3.5疑似病树调查结果

3.6 Y型荧光探针对阳性松木感染病原线虫的检测

4讨论

4.1该松材线虫早期检测体系的技术优势

4.2引物和探针的设计

4.3 Y型荧光探针的设计合理性与特异性检验

4.4 Y型探针-荧光PCR体系的特异性与灵敏性

4.5早期诊断体系的实际效果

第五章松材线虫与拟松材线虫的差异蛋白质组研究

1引言

2材料和方法

2.1实验材料

2.2实验方法

3结果与分析

3.1松材线虫和拟松材线虫的蛋白质表达差异

3.2差异表达蛋白点的MALDI-TOF质谱分析与鉴定

4讨论

4.1双向电泳过程中出现的问题及解决方法

4.2质谱分析与肽指纹图谱

4.3跨物种蛋白鉴定在该研究中的应用

4.4差异蛋白与松材线虫致病机理的讨论

总结

参考文献

致谢