大肠杆菌系统改造及琥珀酸和5-氨基乙酰丙酸合成途径的构建

摘要

进入21世纪，随着环境污染和石油资源的日益枯竭，可持续发展已经深入人心。而工业微生物作为可持续发展的一个重要支撑，是解决资源危机、生态环境危机以及改造传统产业的关键所在。目前，工业微生物技术已经渗透到包括医药、农业、能源、化工、环保等几乎所有的工业领域，并扮演着越来越重要角色。而代谢工程已经发展成为一种最有力的优化微生物代谢途径、提高微生物目标产物生产能力的工具。大肠杆菌作为一种研究最透彻的模式微生物具有无可比拟的优越性：遗传背景清晰、易操作、生长迅速、营养要求简单等。因此，通过基因工程改造大肠杆菌发酵生产重要的工业产品，实现工业原材料来源的根本转变具有重要意义。
　　 本研究首先在分析了大肠杆菌基因表达调控方式的基础上，构建了一种环境压力诱导型的表达系统。该系统不依赖于人为诱导剂的添加，当菌体进入对数生长期后期，该系统被诱导并转录下游基因。在分析该表达系统的特点后，成功将该系统应用于聚羟基丁酸酯(PHB)的发酵生产中。发酵结果显示工程菌株DH5α(pQKZ103)在不添加任何诱导剂的条件下积累菌体干重、PHB浓度以及PHB含量分别为4.1 g/L、3.52 g/L和85.8 wt％；而对照菌株DH5α(pBHR68)在添加0.1mM IPTG诱导后，菌体干重、PHB浓度及PHB含量分别为2.3 g/L，0.98g/L和42.6 wt％。显然，本研究所构建的环境压力诱导型表达系统明显优于IPTG诱导系统。
　　 在构建了环境压力诱导型表达系统后，具体针对大肠杆菌葡萄糖中心代谢进行了分析。在大肠杆菌发酵葡萄糖生产重组蛋白以及化工原料时，如何解决乙酸分泌问题一直受到大家的关注。大约30％的葡萄糖流向了乙酸的生成，不仅造成了浪费，同时，乙酸的积累对菌体的生长造成了巨大的毒害。在系统分析葡萄糖代谢的基础上，我们采用基因敲除的方法，对大肠杆菌中乙酸相关基因ptsG、poxB、pta以及iclR进行缺失，分析每个基因对乙酸积累的影响。最终构建了乙酸分泌量大大减少的好氧发酵菌株QZ1110平台。同时，构建了非编码sRNA的表达载体。在菌株QZ1110中过量表达RyhB sRNA，分析RyhB sRNA对葡萄糖代谢的影响(琥珀酸积累提高7倍)。培养结果初步证实了sRNA作为调节基因表达的工具应用于代谢工程的可行性。随后，通过敲除sdhA基因，构建了琥珀酸好氧发酵途径，QZ1111工程菌株积累琥珀酸至26.4 g/L。
　　 从氧化还原平衡的角度分析，琥珀酸相对于葡萄糖具有更高的氧化还原电势，而PHB相对于葡萄糖具有更低的氧化还原电势。因此，将PHB合成途径引入琥珀酸好氧发酵菌株，成功构建了发酵葡萄糖联产琥珀酸和PHB的工程菌株QZ1112。培养结果显示，联产琥珀酸和PHB相比琥珀酸单独发酵具有更大的优势，葡萄糖得到了更好的利用。基于生物炼制的思想，构建了同时利用甘油(或葡萄糖)和脂肪酸联产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯(PHA)的工程菌株，这为利用生产生物柴油中产生的副产物提供了一个选择。
　　 在构建琥珀酸发酵菌株的基础上，将研究集中在与琥珀酸相关的另一种重要的化合物：5-氨基乙酰丙酸(ALA)。过去，该氨基酸主要通过化学合成法合成。近年来，基于C4途径的生物转化法吸引了众多学者的关注和研究，即通过人为添加琥珀酸和甘氨酸继而通过培养的细胞一步催化生成ALA。而本研究则独辟蹊径，意在通过基于大肠杆菌ALA C5合成途径的改造，构建一株、以廉价无机盐为培养基发酵葡萄糖生产ALA的工程菌株。通过培养，证实hemA基因是C5合成途径中第一个限速酶，同时发现hemL也是C5途径中的关键酶。工程菌株DAL(hemAM，hemL)积累ALA达到2.05 g/L。通过培养发现gltX基因的表达不利于ALA的积累，而荧光定量PCR证实gltX基因的表达不利于ALA的积累的原因是由于gltX基因的表达上调了hemB基因的表达。为了加速ALA的细胞外排，降低细胞内ALA的浓度，分析了ALA的胞外运输相关蛋白并过量表达rhtA基因，培养结果显示，rhtA的过量表达显著提高了ALA的产量(45.9％)。而通过发酵罐培养，ALA的最大产量为4.13 g/L。在大肠杆菌中，hemB基因编码HemB，催化ALA生成胆色素原，因此，可控降解HemB可能有利于ALA的积累。通过在基因组上hemB基因的C端添加一段蛋白质降解标签ssrA。在小分子蛋白SspB的协助下，加有ssrA降解标签的HemB蛋白可迅速被ClpXP蛋白酶体降解，从而起到降解HemB的目的。然而意想不到的是，降解HemB蛋白不仅没有提高ALA.的产量，反而降低了ALA的产量f25mg/L)，而在敲除sspB基因后，ALA.的产量恢复至735 mg/L。这说明降解HemB不利于ALA的积累。