7-酮基胆甾醇壬二酸单酯对巨噬细胞胆固醇转运的调控作用

摘要

动脉粥样硬化作为心脑血管疾病的病理学基础，已成为导致人类死亡的主要原因。由氧化低密度脂蛋白（Oxidized low density lipoprotein， oxLDL）驱动的巨噬细胞泡沫化在动脉粥样硬化发病机制中发挥了关键作用。研究显示，清道夫受体CD36及血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1(Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1，LOX-1)密切参与并调控了巨噬细胞泡沫化的形成，因此研究二者与oxLDL的相互作用关系，并阐明该作用对胆固醇转运过程的调控机制，对预防和治疗动脉粥样硬化具有重要的意义。在前期研究中，从oxLDL脂类提取物中分离得到一种新型表位结构—7-酮基胆甾醇壬二酸单酯（7-ketocholesteryl carboxynonanoate，oxLig-1），并推测oxLig-1很可能介导了oxLDL与清道夫受体CD36、LOX-1的结合作用，从而调控了巨噬细胞对oxLDL的摄取及转运过程。为了进一步明确oxLDL诱导巨噬细胞泡沫化形成的作用机制，本论文以oxLig-1、CD36及LOX-1为研究对象，主要从以下几个方面展开了研究。
　　首先通过分子对接模拟、酶联免疫分析(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)以及表面等离子体共振技术(Surface plasmon resonance，SPR)分别对oxLig-1与CD36、LOX-1的结合作用加以研究，结果发现oxLig-1作为表位结构介导了oxLDL与清道夫受体CD36、LOX-1的结合作用，并且该结合作用表现出高度的结合亲和性。随后分别对oxLig-1的各亚结构组份以及甲基化修饰物进行分析后发现，oxLig-1的疏水核心结构为结合作用提供了疏水作用，而ω-COOH则是结合过程中的主要位点，为结合构象的稳定和结合作用的加固发挥了关键作用。
　　其次借助慢病毒介导的基因沉默技术分别构建得到CD36及LOX-1稳转基因沉默巨噬细胞株，并以此为模型在细胞水平验证了oxLig-1与CD36、LOX-1的结合作用。随后利用基因沉默细胞模型以及激光共聚焦技术分析了CD36介导oxLDL吞噬的具体机制。结果显示，oxLig-1可在细胞膜表面同CD36以及Caveolin-1发生共定位，同时oxLig-1及oxLDL的刺激作用可诱导Caveolin-1发生膜向移位以及聚集。与之相比oxLig-1的甲基化修饰物(me-oxLig-1)未表现出此作用。进一步研究发现，Caveolin-1构成的脂筏结构密切参与了巨噬细胞吞噬摄取oxLDL的过程，而CD36及Caveolin-1的基因沉默均大幅减少了胆固醇在细胞中的积累，表明CD36在与oxLDL表位结构oxLig-1结合后，能够启动Caveolin-1脂筏的形成，并通过此方式介导了oxLDL的吞噬和摄取作用。
　　再次研究了oxLig-1与CD36的结合作用对Caveolin-1蛋白表达的影响及相关调控机制。免疫共沉淀、基因沉默及抑制剂干预实验结果显示，oxLig-1与CD36结合作用在启动脂筏形成以及oxLDL吞噬摄取作用的同时，能够激活CD36下游Src-JNK/ERK信号传导通路，导致核转录因子NF-κB被活化，进而上调了Caveolin-1的蛋白表达，最终进一步加速了Caveolin-1脂筏的形成以及oxLDL的吞噬摄取作用。
　　最后评价了LOX-1在巨噬细胞胆固醇转运过程中的作用。结果发现，LOX-1基因沉默明显增强了巨噬细胞胆固醇蓄积作用。Western blot实验结果显示，oxLDL以及oxLig-1的刺激作用可通过浓度和作用时间依赖的方式上调ABCA1(ATP bindingcassette transporter A1)的蛋白表达，而oxLig-1的甲基化修饰和LOX-1蛋白表达缺失均能够抑制此上调作用。进一步的报告基因及抑制剂干预实验结果表明，oxLDL在启动巨噬细胞泡沫化的同时，还可通过其表位配体oxLig-1与LOX-1的结合作用诱导核转录因子PPARγ(Peroxisome proliferator activated receptorγ)发生活化，进而启动PPARγ-LXRα-ABCA1信号传导通路，上调ABCA1的蛋白表达，最终促进了胆固醇逆转运作用，避免胆固醇在细胞中过度蓄积。
　　本论文阐明了oxLDL与CD36及LOX-1的相互作用关系，并明确了该结合作用在巨噬细胞胆固醇转运过程中的调控机制，为今后以此为靶点开发治疗动脉粥样硬化的相关药物奠定了基础。

目录

声明

摘要

图目录

表目录

主要符号表

1 绪论

1．1 动脉粥样硬化概述

1．2 动脉粥样硬化的发病机理

1．3 氧化低密度脂蛋白与动脉粥样硬化

1．3．1 氧化低密度脂蛋白的形成

1．3．2 oxLDL的致病性

1．3．3 oxLDL氧化衍生物与动脉粥样硬化

1．4 巨噬细胞泡沫化在动脉粥样硬化中的作用

1．4．1 巨噬细胞的由来及分型

1．4．2 巨噬细胞的泡沫化过程

1．4．3 清道夫受体CD36的研究现状

1．4．4 清道夫受体LOX-1的研究现状

1．4．5 脂筏蛋白Caveolin-1的研究现状

1．5 胆固醇逆转运作用

1．5．1 胆固醇逆转运过程

1．5．2 ABCA1的研究现状

1．6 动脉粥样硬化的治疗策略

1．7 本文的研究思路

2 新型配体oxLig-1介导oxLDL与CD36及LOX-1的结合作用

2．1 引言

2．2 实验材料与仪器

2．2．1 实验材料与试剂

2．2．2 试剂配制

2．3 实验方法

2．3．1 分子对接模拟

2．3．2 LDL的体外氧化修饰

2．3．3 oxLig-1的化学合成

2．3．4 ELISA方法分析CD36及LOX-1与oxLig-1的结合活性

2．3．5 ELISA分析oxLig-1在oxLDL与CD36及LOX-1结合过程中的作用

2．3．6 通过表面等离子共振技术分析oxLig-1与CD36的结合力强弱

2．3．7 数据统计学分析

2．4 结果与讨论

2．4．2 ELISA方法分析oxLig-1与CD36的结合机制

2．4．3 表面等离子共振技术分析oxLig-1与CD36的结合力强弱

2．4．4 oxLig-1与LOX-1结合作用的分子对接分析

2．4．5 ELISA方法分析oxLig-1与LOX-1的结合机制

2．5 本章小结

3 慢病毒介导的CD36及LOX-1基因沉默细胞株的构建

3．1 引言

3．2 实验材料和仪器

3．2．1 细胞株与菌株来源

3．2．2 试剂和仪器

3．2．3 试剂配制

3．3 实验方法

3．3．1 J774a．1与293T细胞的复苏与培养

3．3．2 Total RNA的提取

3．3．4 CD36及LOX-1目的基因的调取

3．3．5 CD36及LOX-1目的基因的切胶回收

3．3．6 CD36及LOX-1目的基因的TA克隆

3．3．7 CD36及LOX-1目的基因片段亚克隆至psiCHECKTM-Ⅱ质粒

3．3．8 CD36-shRNA与LOX-1-shRNA序列设计及慢病毒干扰载体的构建

3．3．9 有效shRNA干扰序列的筛选

3．3．10 慢病毒的包装

3．3．11 慢病毒的浓缩与纯化

3．3．12 嘌呤霉素有效致死浓度的筛选

3．3．13 Polygreen转染增强剂浓度筛选

3．3．14 J774a．1细胞的慢病毒侵染及稳转细胞株的筛选

3．3．15 Western blotting分析

3．3．16 激光共聚焦检测CD36、LOX-1与oxLig-1共定位情况

3．3．17 数据统计学分析

3．4 结果与讨论

3．4．2 CD36与LOX-1干扰序列的筛选

3．4．3 Western blot分析稳转基因沉默细胞株干扰效率

3．4．4 细胞水平分析oxLig-1与CD36、LOX-1的结合作用

3．4．5 细胞水平上分析ω-COOH在oxLig-1与CD36、LOX-1结合过程中的作用

3．5 本章小结

4 oxLig-1与CD36的结合作用对oxLDL吞噬摄取过程的影响

4．1 引言

4．2 实验材料和仪器

4．3 实验方法

4．3．1 细胞培养

4．3．3 siRNA瞬时转染

4．3．4 Western blotting分析

4．3．7 oxLig-1、me-oxLig-1药物刺激作用对Caveolin-1蛋白表达的影响

4．3．10 oxLig-1、me-oxLig-1药物刺激作用对Fyn、JNK、ERK以及NF-κB p65磷酸化的影响

4．3．12 蛋白激酶抑制剂预处理对Caveolin-1蛋白表达的影响

4．3．13 数据统计学分析

4．4 结果与讨论

4．4．1 CD36以及Caveolin-1的基因沉默对胆固醇酯蓄积作用的影响

4．4．2 Caveolin-1在oxLDL吞噬摄取过程中的作用

4．4．3 oxLig-1与CD36的结合作用对Caveolin-1膜向移位和聚集的影响

4．4．4 oxLig-1与CD36的结合作用对Caveolin-1蛋白表达的影响

4．4．5 CD36-Src-JNK／ERK信号传导通路对Caveolin-1蛋白表达的调控作用

4．4．6 核转录因子NF-κB在oxLig-1诱导的Caveolin-1蛋白表达过程中的作用

4．5 本章小结

5．oxLig-1与LOX-1的结合作用对胆固醇逆转运作用的影响

5．1 引言

5．2 实验材料和仪器

5．3 实验方法

5．3．1 细胞培养

5．3．3 激光共聚焦检测LOX-1过表达情况

5．3．4 Western blotting分析

5．3．7 oxLig-1、me-oxLig-1药物刺激作用对LXRα、ABCA1、LOX-1蛋白表达的影响

5．3．9 siRNA瞬时转染

5．3．10 数据统计学分析

5．4 结果与讨论

5．4．1 oxLig-1与LOX-1的结合作用对ABCA1蛋白表达的影响

5．4．2 oxLig-1与LOX-1的结合作用对PPARγ激活的影响

5．4．3 oxLig-1与LOX-1的结合作用对LXRα蛋白表达的影响

5．4．4 oxLig-1与LOX-1的结合作用经由PPARγ-LXRα-ABCA1信号传导通路上调ABCA1的蛋白表达

5．5 本章小结

6 结论与展望

6．1 结论

6．2 创新点

6．3 展望

参考文献

附录

作者简介

攻读博士学位期间科研项目及科研成果

致谢