白介素6基因序列单核苷酸多态与京海黄鸡柔嫩艾美尔球虫抗性的关联分析

摘要

本研究以京海黄鸡为实验材料，采用实时荧光定量法PCR法检测IL-6、IL-8(CXCLi2)、CCLi2基因在鸡柔嫩艾美尔球虫攻毒和非攻毒群体间的组织表达谱差异，研究3个基因在球虫感染中所起作用。进一步通过DNA测序技术，检测炎性细胞因子IL-6（白介素6）基因上游-2200bp至下游500bp区域中的单核苷酸多态(single nucleotidepolymorphism，SNP)，并分析所测SNPs及其单倍型与京海黄鸡柔嫩艾美尔球虫抗性指标之间的关系，为京海黄鸡抗病育种提供分子遗传标记。主要研究结果如下:
　　1、IL-6基因在各组织中均有表达，感染组IL-6基因在盲肠、胸腺、肾脏中表达量极显著高于对(P＜0.01)，在法氏囊中表达量显著高于对照组(P＜0.05);IL-8基因在各组织中均有表达，在腺胃、盲肠和胸腺中表达量极显著的高于对照组(P＜0.01)，在脾和小肠中表达量显著高于对照组(P＜0.05);CCLi2在各组织中均有表达，感染组在脾和胸腺中表达量极显著高于对照组(P＜0.01)，在腺胃、盲肠、肾脏中显著高于对照组(P＜0.05)。
　　2、以IL-6为候选基因测序共发现了28个突变位点，与GenBank上进行比较，新发现了4个突变位点。其中位于5'调控区的单核苷酸突变有19个，除去GenBank有记录的SNPs，新发现3处突变;位于内含子的SNPs有2个;位于外显子的SNPs有2个，均为同义突变;位于3'区的SNPs有5个。
　　3、本试验对京海黄鸡IL-6基因28个SNPs位点与抗性指标进行关联分析，发现其中有13个位点与抗性指标有关联。其中与丙二醛(Malondialdehyde，MDA)有显著关联的SNPs有3个，分别为1、6、25号变异位点;与白介素2有显著关联的SNPs有6个，分别是7、12、16、17、20、21号变异位点;与谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)有关联的SNPs有3个，分别是12、15、17位点;14号位点SNP与一氧化氮有显著关联;与白介素17有显著关联的SNPs位点是17和19;与过氧化氢酶(Catalase，CAT)有显著关联的SNPs位点为19和28;19号位点与白介素16有显著相关。
　　4、对5'调控区与抗性指标有关的9个SNPs位点进行单倍型分析:H2H3单倍型组合IL-17的浓度显著高于其他单倍型组合的浓度(P＜0.05); H2H5单倍型组合GSH-Px浓度显著高于H1H1、H1H2和H1H5单倍型组合(P＜0.05);H1H2、H1H4、H2H5单倍型组合MDA浓度显著的高于单倍型组合H1H1、H1H5、H2H3(P＜0.05);单倍型组合H2H5IL-2浓度显著的高于单倍型组合H1H1、H1H2和H1H5。对内含子和3'端与抗性指标有关的4个SNPs位点进行单倍型分析:H2'H3'单倍型组合的NO浓度显著的低于H1'H3'单倍型组合(P＜0.05)，CAT浓度显著的低于H2'H2'单倍型组合(P＜0.05);H2'H2'单倍型组合超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)浓度显著高于H2'H3'、H3'H3'单倍型组合(P＜0.05)，H1'H5'单倍型组合的SOD浓度显著高于H3'H3'单倍型组合(P＜0.05);单倍型组合H1'H2'、H2'H3' IL-2的浓度显著的高于H1'H1'单倍型组合(P＜0.05)，IL-16的浓度显著高于单倍型组合H1'H3'、H1'H5'(P＜0.05)。

目录

论文说明

摘要

中英文对照表

第一章 文献综述

1 鸡的球虫病

1．1 鸡球虫病的危害

1．2 鸡球虫病的预防控制现状和发展趋势

2 IL-6细胞因子的研究进展

2．1 鸡IL-6-分子生物学特点和基因组成

2．3 IL-6细胞因子与鸡球虫病抗性的关系

3 鸡球虫病抗性相关的评价指标

3．3 β-胡萝卜素(β-Carotene，β-C)

3．5 抗氧化系统酶

3．6 肿瘤坏死因子(tuirlor necrosis factor，TNF)

4 京海黄鸡简介

5 本研究的目的意义

第二章 球虫感染对京海黄鸡不同组织IL-6，IL-8和CCLi2表达量的影响

1 材料与方法

1．1 试验动物

1．2 组织样本采集

1．3 主要仪器与设备

1．4 主要实验试剂

1．5 主要试剂配制

1，6 鸡组织总RNA的提取和检测(Trizol法)

1．7 cDNA的合成

1．8 荧光定量引物设计

1．9 实时荧光定量PCR

1．10 荧光定量结果分析

2 结果与分析

2．1 RNA提取结果

2．2 目的基因熔解曲线

2．3 基因组织表达谱分析及感染球虫后表达的变化

3 讨论

第三章 IL-6基因单核苷酸突变

1 材料与方法

1．1 试验动物及病原

1．2 血样采集

1．3 主要仪器与设备

1．4 主要实验试剂

1．5 主要试剂的配制

1．6 鸡血液DNA的提取

1．7 引物设计

1．8 PCR扩增体系和条件

1．9 CE测序

2 数据统计与分析方法

2．1 序列比对

2．2 基因频率和基因型频率的计算

2．3 Hardy-Weinberg平衡状态的检验

3 结果与分析

3．1 基因组DNA的提取效果检测

3．2 IL-6基因测序结果

3．3 IL6基因上游启动子区SNP突变位点转录因子预测

4 讨论

4．2 IL-6基因5’调控区多态性

4．4 IL-6基因外显子多态性

第四章 京海黄鸡IL-6基因单核苷酸突变与柔嫩艾美尔球虫抗性指标的关联分析

1 材料与方法

1．1 试验动物及病原

1．2 主要仪器设备与型号

1．3 抗性指标的测定

2 数据统计与分析方法

2．2 单倍型分析

2．3 关联性分析

3 结果与分析

3．1 京海黄鸡IL-6基因单核苷酸突变与球虫病抗性指标的关联分析

3．2 IL-6基因各变异位点的连锁不平衡分析

3．3 单倍型分析

4 讨论

4．1 IL-6基因单核苷酸突变与抗性指标的关联性

4．2 连锁不平衡分析

4．3 单倍型分析

全文结论

参考文献

攻读学位期间发表学术论文

致谢

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