囊泡运输相关蛋白FgMon1及其结合蛋白FgRab5/7在小麦赤霉病菌生长发育及致病过程中的功能研究

摘要

小麦赤霉病是小麦生产上一种重要的真菌病害，在世界各产麦国普遍发生。小麦赤霉病发病时导致小麦穗部呈现白穗症状，并导致谷粒感病。在造成严重经济损失的同时，感病麦粒中含有脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol)和玉米赤霉烯酮(zearalenon)等真菌毒素，食用后严重威胁着人、畜的生命健康。然而目前还没有有效方法来控制赤霉病的发生，现阶段主要利用杀菌剂来防治赤霉病，但大规模的使用化学药剂给环境及生物带来不利影响。因此，解析小麦赤霉病菌的致病分子机制，可为寻找新的赤霉病菌防治方法提供理论依据。
　　在真核生物的内膜系统中，囊泡携带着蛋白、脂质等物质，从供体运送到受体，在这个过程中膜融合作用起着重要作用。Mon1和Ccz1是在细胞质向液泡定向运输途径(Cvt)中首先被发现的基因，更深入的研究表明Mon1和Ccz1在酵母液泡的同型融合和调控囊泡运输过程中发挥重要作用。近期的文章表明，Mon1-Ccz1作为Rab7的鸟甘酸交换因子(GEF)调控胞吞作用。
　　本文通过同源序列比对，在小麦赤霉病菌基因组数据库中找到一个与酵母MON1同源的基因，命名为FgMON1。通过系统发育分析，发现Mon1在丝状真菌的进化过程中是保守的。通过对小麦赤霉病菌中的FgMON1敲除后发现其在小麦赤霉病菌的生长发育、有性生殖和致病性及毒素的产生中起着重要作用。另外，我们还发现FgMon1参与小麦赤霉病菌的分生孢子的产生、孢子形态建成和菌丝细胞壁完整性过程。通过FM4-64染色发现ΔFgmon1突变体胞吞作用延缓，CMAC染色发现突变体液泡融合受阻、细胞自噬过程受到影响。进而对FgMon1蛋白进行了亚细胞定位，发现该蛋白主要定位在小麦赤霉病菌分生孢子的液泡及胞质中，这可能与其参与液泡融合、细胞自噬作用相关。通过酵母双杂交和体外GST-pull down发现FgMon1与Rab GTPaseFgRab7存在互作关系。对FgRAB7敲除后发现其在小麦赤霉病菌的生长、致病性、膜泡融合及自噬过程中发挥重要作用。进一步研究发现FgMon1与FgRab7Q67L、FgRab7T22N都有互作关系。FgMon1可能作为FgRab7的GEF，能够将FgRab7激活。上述结果表明，FgMon1与FgRab7作为关键组分调控囊泡运输、胞吞作用和细胞自噬，进而影响小麦赤霉病菌的生长发育、致病性和毒素的产生。
　　在酵母和哺乳动物细胞中，早期内涵体发育成熟为晚期内涵体需要Rab5到Rab7的转化，Mon1-Ccz1复合物能被Rab5-GTP招募到晚期内涵体膜上，同时Mon1-Ccz1作为Rab7的GEF，能够招募Rab7并将其激活，从而促进囊泡通过晚期内涵体到液泡中进行降解。为了探究Rab5-Mon1-Rab7作用模块在小麦赤霉病菌囊泡运输过程中的作用，首先通过酵母双杂发现FgMon1与Rab5在小麦赤霉病菌中的同源蛋白FgRab5A、FgRab5B都相互作用，进而对FgRAB5A、FgRAB5B的功能进行分析。利用同源重组原理，通过基因敲除的方法获得相应的突变体。结果表明Fgrab5A、Fgrab5B影响小麦赤霉病菌的营养生长、有性生殖、分生孢子形成、致病力及毒素的合成，并且参与调控小麦赤霉病菌的液泡融合与胞吞作用。由此推测，FgMon1与FgRab5A、FgRab5B、FgRab7作为一个模块共同调控囊泡运输、胞吞作用和细胞自噬，进而影响小麦赤霉病菌的生长发育、致病性和毒素的产生。
　　综上所述，Rab蛋白、GEF和效应蛋白SNARE蛋白构成了一个Rab蛋白调控囊泡运输的作用模块。本文通过对小麦赤霉病菌中囊泡运输作用模块相关基因FgMON1、FgRAB5、FgRAB7的研究推测，FgMon1通过激活FgRab7并与FgRab5、FgRab7之间的动态结合而可能参与调控囊泡与内涵体的融合过程，通过调控液泡融合，进而影响胞吞作用和细胞自噬作用，进而影响了小麦赤霉病菌的生长发育及致病性过程。

目录

声明

摘要

上篇 文献综述

第一章 真核细胞胞吞作用研究进展

1 囊泡运输(Vesicule transport)

2 细胞内囊泡运输的膜融合

3 细胞自噬(Autophagy)

4 小麦赤霉病菌概况

5 小麦赤霉病菌中胞吞途径相关基因研究意义

参考文献

下篇 研究内容

第一章 胞吞作用相关基因FgMON1和FgRAB7在小麦赤霉病菌生长发育及致病过程中的功能分析

1 材料与方法

2 结果分析

3 讨论

参考文献

第二章 胞吞作用相关基因FgRAB5A、FgRAB5B在小麦赤霉病菌生长发育及致病过程中的功能分析

1 材料与方法

2 结果分析

3 讨论

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的研究论文

致谢