生物农药多杀菌素生产菌株的选育及发酵工艺优化研究

摘要

多杀菌素(Spinosad)是由刺糖多孢菌(Saccharopoly sporaspinosa)产生的次级代谢产物，具有明显的抗虫活性。它是一种大环内酯类抗生素，其最主要的活性成分是多杀菌素A和D。多杀菌素因其对许多昆虫具有毒性而对哺乳动物没有毒性，被广泛应用于蔬菜、水果、观赏植物及粮食储藏的害虫防治。本文以刺糖多孢菌ATCC49460作为研究对象，研究了该菌的复合诱变选育及其培养基优化，5L发酵罐中基于两阶段pH调控补料分批发酵和葡萄糖脱氢酶基因(gdh)的克隆表达对多杀菌素合成的影响。
　　1.以自然筛选获得的S.s1-4为出发菌株，通过紫外(UV)和亚硝基胍(NTG)结合链霉素、安普霉素、鼠李糖抗性因子复合诱变选育，获得了一株遗传性状稳定的多杀菌素高产菌株S.s3-37，其产量为78.26mg/L，比出发菌株提高了45.71％。通过单因素实验对其发酵条件进行优化，得到最优培养条件为:初始pH7.2，接种量12％装液量40mL/250mL。
　　2.对S.s3-37突变株进行发酵培养基优化，首先通过单因素实验确定了培养基的最佳碳源和氮源。然后利用Plackett-Burman实验设计对发酵培养基中的7种成分进行筛选，得到葡萄糖、糊精和棉籽蛋白为影响多杀菌素发酵的3个较为显著的因素。然后利用Box-Behnken响应面实验设计对上述三种成分进行优化，获得最优培养基配方为(g/L):葡萄糖54.3、糊精15.5、棉籽蛋白25.7、氯化钠3，磷酸氢二钾1，硫酸亚铁0.05，碳酸钙1。优化后多杀菌素产量达83.00mg/L，提高了6.06％。
　　3.在5L发酵罐中考察了pH调控对多杀菌素补料分批发酵的影响，分别维持发酵液pH为7.4、7.2、7.0、6.8和6.6，在恒定pH条件下发现最适菌体生长的pH为7.2，此时菌体浓度为33.08g/L，最适多杀菌素合成的pH为6.8，此时产量为72.28mg/L。结果表明，多杀菌素合成及菌体生长的最适pH不同，由此提出了两阶段pH调控策略，即在发酵起始阶段维持pH7.2，持续一段时间后将pH缓慢调至6.8。
　　通过采用这种方法，考察了不同调控时间对多杀菌素发酵的影响，分别将pH7.2维持48h，60h，72h和84h后，将pH调节至6.8，并持续到发酵结束。结果表明pH7.2维持60h后降为6.8有利于产物合成，多杀菌素产量达86.16mg/L，较恒定pH条件提高了19.20％。
　　4.基于上述pH调控策略，进行补料分批发酵，根据葡萄糖的消耗速率流加补料成分，使葡萄糖浓度维持在10g/L左右。首先进行间歇补料分批发酵，每隔8h分别流加一定量的葡萄糖、葡萄糖和棉籽蛋白、全料，多杀菌素产量分别达128.87mg/L、135.89mg/L、139.43mg/L，发现间歇流加全料时产量最高，并且其菌体浓度达48.89g/L，产率达15.49mg·L-1·d-1。然后采用连续流加方式进行补全料，结果表明菌体浓度和产量有进一步的提高，分别达52.89g/L和146.83mg/L，较不补料分别提高了62.49％和70.42％，产率达15.73mg·L-1·d-1，较间歇补料提高了1.55％。
　　5.通过提高限速步骤中葡萄糖脱氢酶基因(gdh)的表达量，能解除限制步骤对合成速度的影响。首先在pOJ260质粒中插入permE强启动子，通过PCR扩增得到gdh目的基因，连接pMD19-T载体，导入大肠杆菌DH5α中进行克隆，提取质粒进行酶切，将酶切产物连接到pOJ260质粒强启动子的下游，完成重组表达质粒的构建，转化大肠杆菌S17-1，用接合转移的方法将重组表达质粒导入刺糖多孢菌中，最后挑取转化子进行验证，在摇瓶中进行发酵，其最高产量达89.47mg/L，较出发菌株提高了14.32％。结果表明，gdh基因的过量表达对多杀菌素的合成有较好的促进作用，为后续基因工程菌的构建打下了良好的基础。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 生物农药概述

1．2 多杀菌素研究概述

1．2．1 多杀菌素的开发与应用

1．2．3 多杀菌素的性质

1．2．4 多杀菌素的生物合成

1．2．5 多杀菌素的作用机理与毒性

1．2．6 多杀菌素的应用

1．2．7 多杀菌素的分析检测方法

1．3 多杀菌素的发酵生产

1．3．1 菌种特性

1．3．2 多杀菌素产生菌的选育

1．3．3 多杀菌素的发酵工艺研究

1．3．4 本课题的研究目的、意义和内容

第二章 多杀菌素产生菌复合诱变选育及发酵培养基优化

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 菌种

2．2．2 试剂与材料

2．2．3 仪器与设备

2．2．4 相关溶液的配制

2．2．5 培养基

2．2．6 培养方法

2．2．7 分析方法

2．2．8 实验方法

2．2．9 优化方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 多杀菌素标准曲线

2．3．2 出发菌株的自然筛选

2．3．3 抗性平板中链霉素、安普霉素、鼠李糖浓度的确定

2．3．4 紫外诱变

2．3．5 亚硝基胍诱变

2．3．6 遗传稳定性结果

2．3．7 培养条件对突变菌株S．s 3-37发酵的影响

2．3．8 不同碳源对多杀菌素发酵的影响

2．3．9 不同氮源对多杀菌素发酵的影响

2．3．10 Plackett-Burman实验设计

2．3．11 最陡爬坡实验

2．3．12 响应面法优化多杀菌素发酵培养基

2．4 本章小结

第三章 基于两段pH调控补料分批发酵的工艺研究

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 菌种

3．2．2 试剂与材料

3．2．3 仪器与设备

3．2．4 相关溶液的配制

3．2．5 培养基

3．2．6 分析方法

3．2．7 培养方法

3．2．8 实验方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 恒定pH对多杀菌素分批发酵的影响

3．3．2 不同pH调控时间对多杀菌素分批发酵的影响

3．3．3 两阶段pH调控策略下间歇补料对多杀菌素发酵的影响

3．3．4 两阶段pH调控策略下连续补料对多杀菌素发酵的影响

3．4 本章小结

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 菌种与质粒

4．2．2 试剂与材料

4．2．3 仪器与设备

4．2．4 相关溶液的配制

4．2．5 培养基

4．2．6 实验方法

4．3 结果与讨论

4．3．1 刺糖多孢菌gdh基因的克隆

4．3．2 表达载体的构建

4．3．3 接合转移

4．3．4 基因工程菌的发酵

4．4 本章小结

5．1 结论

5．2 创新点

5．3 展望

参考文献

图表目录

致谢

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