基于多重置换扩增的多倍点PCR分析与多重巢式PCR方法在单细胞水平诊断DMD的比较研究

摘要

杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy，DMD; OMIM310200)是一种神经肌肉系统常见的X-连锁隐性遗传病，主要累及男婴，在存活男婴中发病率约1/3500～1/6000，其主要临床特征为缓慢进行性加重的对称性肌肉无力和萎缩，患者多起病于3～5岁，出现走路姿势异常、易跌倒、肌无力等症状，12岁前丧失站立和行走能力，20岁左右死于呼吸困难、心力衰竭。本病是由位于Xp21.2的dystrophin基因突变导致，该基因全长约2.4Mb，约占X染色体全长的1.5％，是目前人类已发现的最大基因，其cDNA全长13974bp，共有79个外显子，其编码一种相对分子质量为32万道尔顿的肌养蛋白。近65％患者由一个或多个dystrophin基因外显子的缺失所致，5％由重复突变导致，30％由点突变导致。
　　胚胎植入前遗传学诊断(Preimplantation genetic diagnosis，PGD)可通过筛选正常的胚胎移植，以防止遗传学异常妊娠的发生，避免了反复流产、引产对孕妇及其家庭造成的伤害。
　　目前已有DMD-PGD相关报道，多重巢式PCR、连锁分析、限制性酶切等方法都在其PGD考虑之中，但这些方法仅限于对单细胞几个位点进行直接扩增，有位点少、扩增效率低、不能重复、条件要求高等缺点。对于临床PGD十分不利，因此全基因组扩增将模板量大幅提高，避免上述问题的产生。目前全基因组扩增已发展出引物延伸预扩增(Primer extension preamplification，PEP)技术和简并寡核苷酸引物 PCR(Degenerate oligonucleotide primed-polymerase chainreaction，DOP-PCR)技术及多重置换扩增技术(multiple displacementamplification，MDA)。MDA技术已成为目前最有发展前景的WGA技术。
　　目的:
　　本研究通过使用多重巢式PCR和MDA的全基因组扩增技术对4个DMD家系完成PGD预实验，在实验中优化DMD-PGD预实验流程，并对多重巢式PCR和MDA-WGA方法对单细胞的扩增效率及诊断准确率和ADO发生率进行评估，对DMD-PGD中现有的10个STR位点进行有效率评价，最后对其中存在的问题进行讨论分析。
　　材料:
　　本研究材料来自4个家系中患者或（和）其直系亲属，患者及相关成员外周血标本于我院遗传中心抽取，并进行抽提gDNA和分离单淋巴细胞。
　　家系Ⅰ:分子编号M13742，家系中女性携带者年龄34岁，生育一患儿，基因诊断提示女性携带者的dystrophin基因第12-16号外显子杂合缺失;
　　家系Ⅱ:分子编号M5841，家系中女性携带者年龄41岁，生育一患儿，基因诊断提示女性携带者的dystrophin基因存在c.7705C＞T杂合无义突变，并曾经行连锁分析;
　　家系Ⅲ:分子编号M13501，家系中女性携带者年龄41岁，生育一患儿，14岁夭折，但未保留样本，基因诊断提示女性携带者的dystrophin基因存在c.6318G＞A杂合无义突变，取女性携带者及其父母血样;
　　家系Ⅳ:分子编号M13691，家系中仅有患儿，为新发生突变，基因诊断提示患儿的dystrophin基因存在第48-52号外显子缺失，其母亲则未见异常，年龄40岁。
　　方法:
　　1、制备单个淋巴细胞和抽提外周血gDNA
　　2、家系gDNA水平PCR扩增和荧光-PCR扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光电泳对DMD-STR位点2CA、5CA、7CA、44CA、45CA、49CA、50CA、59CA、63CA、79CA进行连锁分析，确定能提供连锁信息的位点。
　　3、单个淋巴细胞通过多重巢式PCR或MDA-WGA进行初级扩增
　　4、多重巢式PCR初级扩增产物和MDA纯化产物各位点的荧光PCR的扩增
　　5、通过测序仪荧光电泳对荧光PCR产物进行分析及通过琼脂糖凝胶电泳对缺失位点普通PCR产物进行分析
　　6、对需要测序的PCR产物进行回收、纯化及测序分析
　　结果:
　　1、单体型分析结果
　　家系Ⅰ单体型分析结果，能提供连锁信息位点共4个，分别为5CA、44CA、45CA、50CA;家系Ⅱ单体型分析结果，能提供连锁信息位点共3个，分别为44CA、49CA、50CA;家系Ⅲ单体型分析结果，能提供连锁信息位点共4个，分别为7CA、44CA、50CA、63CA;家系Ⅳ单体型分析结果，能提供连锁信息位点共6个，分别为2CA、5CA、44CA、45CA、59CA、63CA。
　　2、各家系单淋巴细胞扩增效率及ADO率
　　家系Ⅰ共完成184个位点的扩增，扩增成功及诊断准确率99.5％(183/184)、ADO率为0，家系Ⅱ共完成153个位点的扩增，扩增成功及诊断准确率为99.3％(152/153)、ADO率为0，家系Ⅲ共完成180个位点的扩增，扩增成功及诊断准确率为100％(180/180)、ADO率为1.1％(178/180)，家系Ⅳ共完成480个位点的扩增，扩增成功及诊断准确率为99.8％(479/480)、ADO率为0。
　　3、多重巢式PCR方案和MDA-WGA方案的扩增效率及ADO率比较
　　运用多重巢式PCR扩增方案总共扩增产物337个，扩增成功及诊断准确率为99.4％(335/337)，ADO率为0(0/335);运用MDA-WGA方案总共扩增产物660个，扩增成功率为99.8％(659/660)，ADO率为0.3％(2/659)。经x2检验，两者扩增成功率P＞0.05差异无统计学意义，ADO率P＞0.05，无统计学意义。
　　结论:
　　1、本实验共完成了4家DMD家系的PGD预实验，单细胞多重巢式PCR方案和MDA-WGA方案的各位点扩增成功率均＞90％，ADO率均＜10％，达到临床PGD要求，能够应用于临床PGD，这为DMD患者的临床PGD的开展提供了强有力的技术支撑。
　　2、虽然多重巢式PCR方案和MDA-WGA方案的扩增成功率和ADO率无统计学差异。但MDA-WGA在多位点分析上更有优势，这样能更有效地提高单细胞诊断DMD的准确率。
　　3、多位点连锁分析不仅能监测污染的发生，同时也能完成PGD诊断分析，拓宽了PGD的诊断范围，增加了PGD诊断的准确性，降低了误诊的发生。

目录

声明

摘要

专业缩写词中英文对照简表

1 前言

2 对象、材料与方法

2．1 对象

2．2 材料

2．2．1 单个淋巴细胞的制备

2．2．2 外周血gDNA的抽提

2．2．3 引物

2．2．4 主要试剂

2．2．5 主要耗材

2．2．6 主要仪器

2．3 方法

2．3．1 单体型连锁分析

2．3．2 多重巢式PCR方案

2．3．2 第二轮PCR

2．3．3 MDA方案

2．3．4 PCR产物分析

2．3．5 技术路线

3 结果

3．1 连锁结果

3．1．1 PAGE结果

3．1．2 荧光PCR电泳分析结果

3．2 荧光PCR-电泳结果示例

3．3 单淋巴细胞PCR结果

3．4 双重PCR产物琼脂糖凝胶电泳

3．5 PCR产物测序结果

3．6 污染

4 讨论

4．1 全基因组扩增技术在胚胎植入前遗传学诊断中的应用

4．1．1 胚胎植入前遗传学诊断

4．1．2 全基因组扩增技术

4．2 DMD-PGD预实验方案的选择

4．3 短串联重复序列的使用

4．4 性别鉴定位点的使用

4．5 PGD中的常见问题及解决方案

4．5．1 污染

4．5．2 等位基因脱扣

4．6 多重巢式PCR方案和MDA-WGA方案的比较

4．7 DMD-PGD预实验的意义

5 结论

参考文献

综述 全基因组扩增应用于胚胎植入前遗传学诊断

致谢