我国南方部分地区蝙蝠携带狂犬病毒的病原生态学研究

摘要

狂犬病是由狂犬病毒(Rabies virus，RABV)引起的一种人兽共患自然疫源性疾病，死亡率几乎为100％。在发达国家，人的狂犬病已极为罕见甚至完全消除，犬已经不再是狂犬病传播的主要媒介。我国人狂犬病的发病数位居世界第二，2002年以来年度发病及死亡人数均超过2000例，是严重危害我国公共卫生安全的重要疫病。从建国初至今，我国对动物狂犬病未进行过系统的流行病学统计。因此针对狂犬病的自然宿主——蝙蝠开展RABV的病原生态学研究，对于阐明我国蝠源RABV的分布及遗传衍化关系具有重要意义，对于预警、减少或消灭狂犬病对人类的威胁，具有重要的公共卫生意义。 正确的狂犬病流行病学研究方法离不开制定合理有效的调查程序，包括样品的采集、背景资料的收集整理、研究方法的选择和研究结果的分析。为了获得中国部分地区蝙蝠狂犬病的流行资料，我们首先制定了蝙蝠狂犬病流行病学研究的样品采集方案，依据卫生部发布的人狂犬病疫情公报，将南方狂犬病高发区确定为重点调查采样的地区。最终在中国南方4省(广东省、广西省、云南省和海南省)14个地区和北方吉林省的长春共采集了4科12个蝙蝠品种的1387只外表健康蝙蝠进行了本次病原流行病学调查。至课题完成，共获得蝙蝠脑组织样品1287份，蝙蝠血清样品732份。在上述样品的采/收集时，我们均建立了严格的样品登记制度，详细记录了全部样品的明细档案资料，包括采集当地的狂犬病流行情况、RABV 易感动物种群及分布、人文环境等，同时还建立了严格的档案登记制度，详细记录了与样品相关的流行病学信息，这些资料的收集整理对于后期的数据分析以及防控政策的制定都具有重要意义。 引起狂犬病的RABV是弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus)的成员，作为单股负链RNA病毒，其核蛋白(N)的编码基因——N基因由于型间相对保守和复制过程中的高拷贝的特点，成为病毒分型和分子诊断的目标序列。现已采用系统发生分析的方法将己发现的RABV确定为7个基因型，此外尚有4种待分型。目前我国狂犬病毒野外分离株仅限于基因Ⅰ型，但是考虑到我国地处欧亚大陆，地理环境和多种野生动物栖息的生态环境，使我们有理由怀疑我国可能存在其他基因型的狂犬病毒，即狂犬相关病毒(Rabies-related virus，RRV)。为了快速完成批量样品/不同品质样品的RABV检测，我们参考了不同基因型狂犬病毒的N基因序列，设计了nested RT-PCR 引物并建立了检测方法。灵敏度试验表明，所建立的nested RT-PCR方法可检出0.2TCID<,50>的SRV9细胞毒；灵敏度较MIT法高出100倍。特异性试验表明，本方法可以扩增狂犬病毒的全部基因型的毒株；可供检测的样品包括犬源、牛源、猪源、羊源、蝙蝠源的组织样品，可以用于我国狂犬病毒易感动物带毒的筛查。该方法已在国内多家兽医疾病监控部门应用，反馈效果很好。通过对所收/采集到的动物样品的病原学检测，获得蝠源RABV N 基因部分序列79条，蝠源RABV G基因部分序列19条。检测结果证实，广东蝙蝠脑组织RABV感染阳性率为8.22％(60/730)，广西蝙蝠脑组织阳性率为3.72％(11/296)，云南蝙蝠脑组织阳性率为7.14％(2/28)，海南蝙蝠脑组织阳性率为2.58％(6/233)。在对蝠源RABV序列进行系统发生分析时，我们参考了GenBank收集的我国及世界范围RABV流行株、固定毒株及RRV的基因序列。结果表明，我国蝠源RABV的79条N基因部分序列，核苷酸的最低同源性达81.7％，氨基酸的最低同源性为89.4％。多序列比较证实不同地域毒株问变异的核苷酸位点和氨基酸位点具有明显的规律性；系统发生分析表明，这些毒株归属为三个进化群：Ⅰa、Ⅰb和Ⅰc；群内地域性特征明显，且同源关系较近。结合参考序列数据，证明我国动物源RABV均为基因Ⅰ型，可以划分为5个群，除蝠源RABV独立的三个群外，其他动物源RABV尚组成2个群；世界蝠源RABV流行株地域性分群明显，群间地域性分布与大陆架结构密切相关，中国流行株在其中表现出明显的地域性与进化程度上的保守性。对蝠源 RABV与动物源性RABV G基因的系统发生分析结果表明我国蝠源RABV G基因与我国和其他国家动物源性RABV G基因亲缘关系较远，这可能是我国蝙蝠鲜有传播RABV的原因。 为调查我国蝙蝠感染RABV的情况，本研究利用FITC-Protein A与FITC-ProteinG 混合物作为荧光二抗，建立了能够检测蝙蝠血清抗体的间接免疫荧光染色法(indirect fluorescent antibody test，iFAT)，应用该方法和改良的荧光抗体病毒中和试验(modified FAVN，mFAVN)对我国5个省的11个地区的732份蝙蝠血清样品进行了狂犬病毒抗体检测。结果表明，被检地区的蝙蝠血清中RABV抗体阳性率为3.28％(24/732)。所检测的4科8个品种的蝙蝠中有4个品种呈RABV感染阳性，其中棕果蝠(Rousettus leschenaulti)和水鼠耳蝠(Myotis daubentoni)是感染较为普遍的蝙蝠品种。此外，以荧光抗体病毒中和试验(fluorescent antibody virus neutralization test，FAVN)对 iFAT 检测的、血清量足够的15份阴性和3份阳性棕果蝠血清样品进行验证，结果3份阳性血清也表现出中和抗体阳性，其中和抗体水平分别为：0.15IU/mL，0.08IU/mL，0.33IU/mL，15份阴性血清无中和抗体，检测符合率达100％。以mFAVN方法检测了74份小菊头蝠(Rhioophus blythi)血清，2份呈阳性，中和抗体水平均为0.38IU/mL，在这74份血清中有25份检测呈阴性的血清经iFAT 检测结果亦是阴性，两种检测方法符合率 100％。 本研究首次进行了我国蝙蝠狂犬病的流行病学调查，表明蝙蝠在我国RABV病原生态学中具有明显作用，获得了蝠源RABV的分子流行病学证据，查清了所调查地区蝙蝠的感染/带毒情况，从而部分揭示我国蝙蝠RABV流行毒株的遗传本底，建立蝠源RABV毒株流行病学信息数据库，为今后追踪病毒的传播来源和预报疫情提供了依据。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1狂犬病毒的基本结构

1.1狂犬病毒的病毒粒子结构

1.2狂犬病毒的基因组结构

2狂犬病毒的生态学分类

3狂犬病的发病机制

3.1暴露局部

3.2向CNS移行

3.3 CNS内的扩散

3.4从中枢神经向各器官扩散

4狂犬病的实验室诊断

4.1病原学检测

4.2血清学检测

5实验室生物安全

6与蝙蝠相关的狂犬病流行病学

6.1蝙蝠携带的狂犬病毒

6.2蝙蝠传播狂犬病的方式

6.3蝙蝠狂犬病流行病学研究方法

6.4蝙蝠狂犬病国内外的流行现状

7本课题研究目的和意义

第二章蝙蝠样品的采集及处理

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1蝙蝠的采集

2.2血清样品

2.3脑组织样品

3讨论

第三章动物狂犬病nested RT-PCR检测方法的建立

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

1.3 Nested RT-PCR检测方法的特性检验

2结果

2.1引物的设计

2.2 Nested RT-PCR检测方法的建立

2.3 Nested RT-PCR检测方法的特性检验

3讨论

3.1分子生物学方法在狂犬病检测中的应用

3.2部分N基因片段用以做同源性分析的可行性

3.3建立的检测方法应用价值

第四章我国南方部分地区蝙蝠狂犬病毒的系统发生分析

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1蝙蝠样品的nested RT-PCR检测及阳性片段的克隆测序

2.2我国南方部分地区蝠源RABV部分N、G基因序列比较分析

2.3我国南方部分地区蝠源RABV毒株的系统发生分析

3讨论

第五章我国部分地区蝙蝠狂犬病毒感染的血清学调查

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1 iFAT检测方法的建立

2.2 iFAT检测蝙蝠血清样品

2.3 FAVN检测蝙蝠样品血清

3讨论

第六章结论

参考文献

附录

致谢