细胞色素P450 55A3对NO的催化应用及细胞色素P450 55a1基因的遗传转化

摘要

细胞色素P450(CytochromeP450，简称CYP450)是一类其还原态与CO结合后在450nm处有最大吸收值的血红素蛋白超家族，它广泛分布于各种生物体内。而存在于真菌中的细胞色素P450nor是一类具有将NO还原成N2O作用的酶类，称为一氧化氮还原酶(Cytochrome P450nor)。NO是生物体内重要的信号分子，在植物的生理活动中起到关键的枢纽作用。但NO在生物体内含量很低，而且极易被氧化，因此建立NO快速灵敏检测方法具有重要意义。本论文Cytochrome P450nor对NO的催化能力开展了下几方面研究工作：
　　1.对柱胞菌(Cylindrocarpon.tonknese)细胞色素P45055 a3(cyp55a3)基因在大肠杆菌进行了表达，并将得到的CYP55A3蛋白进行了纯化，得到了单一的蛋白条带。
　　2.在上述基础上，通过构建CYP55A3生物传感器，研究其对NO的催化应用。结果表明，固定在DHP膜内的CYP55A3能催化NO的还原；并获得了NO的表观米氏常数及线性检测范围。
　　3.通过荧光光谱、同步荧光、紫外-可见光谱法研究NO与CYP55A3之间的相互作用。结果表明，NO主要作用于该蛋白中色氨酸微环境中的疏水区域；NO-CYP55A3之间形成的复合物具有显著的稳定性，并得出两者的结合常数K=3.93×104 mol/L；并且NO能使铁卟啉的荧光强度增强，加入NADH后又能使荧光恢复。
　　4.从尖镰胞菌(Fusarium oxysporium)中克隆得到细胞色素 cyp55a1，构建pCAMBIA1302∷cyp55a1∷gfp植物超表达载体，通过农杆菌介导侵染方法对水稻日本晴进行遗传转化。经PCR检测得到T0代阳性植株，并采用RT-PCR技术分析了阳性植株中细胞色素P45055a1基因的表达水平，得到了表达量高的T0代阳性植株。对得到的T0代阳性植株对研究一氧化氮在水稻的生理作用和抗病能力提供了实验材料。

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第1章 绪论

1.1 细胞色素P450的概述

1.2 CYP55A1及CYP55A3的简介

1.3 NO在动植物中的作用

1.4 本文的研究目的和意义

第2章 重组柱孢菌细胞色素P45055A3(P450nor2)的原核表达及纯化

2.1 前言

2.2 实验材料、试剂及设备

2.3 实验方法

2.4 结果及分析

2.5 结论

第3章 细胞色素P450 55A3对NO的传感检测

3.1 前言

3.2 实验材料、试剂及设备

3.3 实验方法

3.4 实验结果

3.5 结论

第4章 细胞色素P450 55A3与NO相互作用的光谱法研究

4.1 前言

4.2 实验材料、试剂及设备

4.3 实验方法

4.4 实验结果

4.5 结论

第5章 尖镰胞菌细胞色素P450 55a1基因超表达载体的构建及水稻日本晴遗传转化

5.1 引言

5.2实验材料、试剂及仪器设备

5.3 实验方法

5.4 结果与分析

5.5 结论

参考文献

致谢

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