甘蓝型冬油菜品种Tapidor春化前后全基因组组蛋白H3K27me3修饰变化及基因表达差异分析

摘要

油菜是世界上重要的油料作物，然而与水稻，拟南芥等传统模式植物相比，有关油菜表观遗传学的研究还未见报道，因此研究油菜中表观遗传修饰具有重要意义。染色质免疫共沉淀技术(ChIP)，是研究表观遗传学的重要手段，目前ChIP实验技术已经广泛应用于各种动植物研究中，但是在油菜中，该技术具体方法尚未有明确的报道。
　　植物开花是植物生命周期中重要的生理转换过程，低温春化则是促进冬性植物开花的重要条件。因此研究冬油菜开花的表观遗传调控机理，对于进一步了解春化促进油菜开花过程的分子机理具有重要意义。本研究主要以春化处理前、后的甘蓝型冬油菜品种Tapidor为实验材料，对ChIP实验技术进行了探索;并利用H3K27me3抗体，结合ChIP-seq、RNA-seq和生物信息学分析等方法，对春化前、后Tapidor全基因组组蛋白H3K27me3修饰变化及差异表达基因进行了分析。主要研究结果如下:
　　1.以拟南芥、玉米、水稻等植物的ChIP实验为参考，调整了ChIP的实验流程和具体参数。其中，我们确定了甲醛交联时间为10min，超声破碎条件为功率20％、时间30min、频率为开2s/关9s，以及免疫沉淀处理等条件，并利用Real-timePCR进行了验证，结果可用于后续ChIP-seq实验。
　　2.ChIP-seq分析结果表明测得序列标签mapping到参考基因组序列上的效率达到90％，但是unique reads只有25％左右。利用MACS1.4软件检测到Tapidor春化前有1607个peaks，春化后则检测到10662个peaks，说明与春化前相比，春化后的全基因组H3K27me3修饰大幅度上调。ChIPseeker软件可视化则表明这些peaks主要分布在基因间隔区和启动子区域，并且在TSS区域上的分布差异明显。同时对所得到的peaks进行基因注释，注释结果表明Tapidor春化前、后有H3K27me3修饰的基因数目分别为513和3146个，所含peaks分别占总peak数目的0.5％和3.1％，其中共同修饰的基因数目为245个。春化前、后H3K27me3修饰基因的表达水平进行的统计分析说明了在甘蓝型油菜中H3K27me3修饰对基因表达有抑制作用。
　　3.RNA-seq分析结果表明测得序列标签mapping到参考序列上的效率均大于90％，差异基因表达分析则表明与春化前相比，春化后共有6947个差异表达基因，其中上调基因3382个，下调基因3565个。对差异基因的GO功能显著性富集分析结果显示差异基因主要集中在细胞器中，其中膜细胞器所占据的比例最大;分子功能注释后的表达差异基因主要与结合作用和酶活性有关;生物过程中差异基因则主要集中在代谢途径、抗逆途径、刺激应答、细胞组成以及信号转导等途径。KEGG Pathway显著性富集分析表明差异基因主要富集在碳水化合物、脂肪、氨基酸的代谢，其次为能量代谢、生物合成中的次生代谢、外源因子降解，信号转导以及免疫系统等方面。
　　4.ChIP-seq与RNA-seq相结合对春化过程中基因的组蛋白H3K27me3修饰变化及表达差异分析表明:与春化前相比，春化后有H3K27me3修饰peaks的表达差异基因共有399个，其中上调基因62个，下调基因337个，百分比分别为84.46％和15.54％。春化过程中FLC基因表达受到H3K27me3的抑制，表现为下调，但是其它春化途径中重要基因的H3K27me3修饰变化不明显。

目录

声明

摘要

缩略词表

1．前言

1．1 表观遗传修饰

1．1．1 表观遗传学概述

1．1．2 表观遗传调控的分子机制

1．2 组蛋白修饰研究

1．2．1 组蛋白修饰概述

1．2．2 H3K27me3研究进展

1．3 组蛋白修饰参与植物春化开花途径

1．3．1 植物开花网络的研究

1．3．2 H3K27me3修饰参与植物春化过程

1．3．3 组蛋白修饰参与其他开花途径

1．4 组蛋白修饰的主要研究方法

1．4．1 ChIP技术简介

1．4．2 ChIP-qPCR、ChIP-seq与ChIP-chip

1．4．3 ChIP-Seq的原理与应用

1．5 数字化基因表达谱技术在油菜中的应用

1．5．1 转录组测序

1．5．2 油菜中差异基因表达谱研究进展

1．6 本研究的目的和意义

2．材料与方法

2．1 实验材料和春化处理、取样方法

2．2 适用于油菜ChIP技术的探索

2．2．1 ChIP抗体与试剂配方

2．2．2 本研究ChIP方法步骤

2．2．3 ChIP结果的检验方法

2．3 ChIP-seq与数据分析

2．3．1 ChIP-DNA高通量测序

2．3．2 ChIP-DNA高通量测序数据分析方法

2．4 转录组高通量测序和数据分析

2．4．1 总RNA的提取方法

2．4．2 转录组测序

2．4．3 转录组测序数据分析方法

3．结果与分析

3．1 油菜ChIP技术的探索结果

3．1．1 交联过程中甲醛交联时间的确定

3．1．2 超声波破碎具体参数的确定

3．1．3 免疫沉淀后结果检测

3．2 ChIP-seq与数据分析结果

3．2．1 ChIP-seq测序数据与mapping效率

3．2．2 富集区域“峰”的预测与修饰基因注释

3．2．3 peaks主要分布在基因间隔区和启动子区域

3．2．4 peaks在TSS区域分布差异明显

3．2．5 H3K27me3修饰对基因表达具有抑制作用

3．3 转录组测序与结果分析

3．3．1 总RNA提取

3．3．2 高通量测序和数据分析

3．3．3 GO功能显著性富集分析

3．3．4 KEGG Pathway显著性富集分析

3．4 基因组H3K27me3修饰变化及基因表达差异分析

3．4．1 春化过程中FLC基因表达下调受到H3K27me3的抑制

3．4．2 春化途径中重要基因的H3K27me3修饰变化不明显

4．讨论

4．1 油菜中ChIP实验技术的探索

4．2 ChIP实验中抗体的选择及检验

4．3 高通量测序数据分析过程中mapping效率的分析

4．4 油菜高通量测序的数据分析

4．5 油菜高通量测序的结果分析

参考文献

附录

致谢