细菌的CYCLIC-Di-GMP信号分子与两个新受体蛋白之间的相互作用研究

摘要

环二鸟苷单磷酸（简称c-di-GMP）是细菌中普遍存在的多功能第二信使分子，广泛参与调控细菌生物膜形成、运动性、细胞周期进程、毒力以及病原-宿主相互作用等过程。分枝杆菌具有独特的c-di-GMP信号系统并能影响其多种生理和病理特性，但是该信号分子如何介导病原性结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)与宿主之间的相互作用还基本不清楚，而且目前在该重要人类病原菌中还没有明确的c-di-GMP信号受体蛋白报道。本研究发现了两个新的c-di-GMP受体蛋白:一个是参与病原-宿主相互作用的人免疫系统噬铁蛋白LCN2，另一个是结核分枝杆菌的莽草酸激酶AroK。
　　1.人噬铁蛋白LCN2是c-di-GMP分子的直接受体。LCN2是人类先天免疫系统的重要抗菌元件，在营养缺乏条件下它通过截获细菌生长必须的铁载体而抑制细菌在宿主体内的存活。首先通过生物信息学方法预测LCN2是c-di-GMP的可能受体，并利用表面等离子共振(SPR)和等温滴定量热（ITC）实验证实，c-di-GMP也与铁载体Fe-Ent/Fe-CMBs一样，能够与rLCN2直接结合。但是，在相似条件下不能清楚探测到rLCN2蛋白与c-di-AMP、GTP和cGAMP等与c-di-GMP类似的其它几个小分子之间的相互作用。这表明，c-di-GMP与rLCN2之间的相互作用具有特异性。进一步，ITC定量测定发现，c-di-GMP滴定rLCN2蛋白的化学计量比是1∶1，亲和力Kd为1.63±0.05μM，表明一分子c-di-GMP结合一分子rLCN2单体蛋白。因此，研究发现了噬铁蛋白LCN2是c-di-GMP的直接受体，细菌在感染过程中可能利用自己的这个信号分子阻塞LCN2蛋白与铁载体的结合，从而解除其抗菌效应。
　　2.结核分枝杆菌莽草酸激酶AroK是c-di-GMP的直接受体。莽草酸激酶AroK是结核分枝杆菌莽草酸途径和细胞壁合成代谢的关键酶，已经成为抗结核药物设计的潜在靶标蛋白。首先选取了大约80个在PDB数据库中有晶体结构信息的结核分枝杆菌H37Rv蛋白，建立了结核分枝杆菌蛋白质文库，筛选文库发现莽草酸激酶AroK是可能的c-di-GMP受体。然后利用紫外交联实验证明放射性同位素标记的c-di-GMP分子能与AroK蛋白直接结合。进一步，利用竞争性结合实验证实c-di-GMP与AroK结合具有特异性。通过ITC定量测定发现，c-di-GMP滴定AroK蛋白的化学计量比是1∶1，亲和力Kd为2.453±0.05μM，表明一分子c-di-GMP结合一分子AroK单体蛋白。通过设计并成功表达纯化AroK一系列关键氨基酸残基突变蛋白，发现了位于催化中心的关键氨基酸Ser16也是AroK蛋白与c-di-GMP相互作用的关键氨基酸。最后，通过测定激酶活性表明c-di-GMP对AroK的酶促反应有明显的抑制作用。因此，AroK是一个新的c-di-GMP受体，c-di-GMP能够直接靶向AroK的活性中心从而影响其酶活。这些结果表明c-di-GMP信号分子可能通过影响莽草酸激酶AroK的活性，调控结核分枝杆菌杆菌的细胞壁分支酸代谢，从而影响病原菌的生长和毒力;同时，该工作也为病原菌莽草酸激酶抑制剂的设计提供了新的线索。

目录

声明

摘要

缩略语

1 前言

1．1 c-di-GMP受体类型

1．1．1 PilZ结构域蛋白

1．1．2 退化的GGDEF／EAL结构域蛋白

1．1．3 转录调控因子

1．1．4 核糖开关

1．1．5 其他受体类型

1．2 分枝杆菌的c-di-GMP系统

1．2．1 分枝杆菌中调控c-di-GMP代谢的酶类

1．3 脂质运载蛋白2(lipocalin 2，LCN2)

1．4 莽草酸激酶

1．5 本课题研究的目的和意义

2 材料和方法

2．1 试验材料

2．1．1 供试菌株

2．1．2 供试质粒

2．1．3 实验所用引物

2．2 试验试剂

2．2．1 供试抗生素

2．2．2 供试培养基

2．2．3 基因克隆相关试剂

2．2．4 蛋白纯化相关试剂

2．2．5 TLC及紫外交联试验相关试剂

2．2．6 其他相关试剂和试剂盒

2．3 实验方法

2．3．1 分子生物学基本操作

2．3．2 蛋白质表达与纯化

2．3．3 大分子相互作用检测

3 结果与分析

3．1．1 SPR实验检测rLCN2蛋白特异性结合c-di-GMP

3．1．2 SPR实验鉴定rLCN2结合c-di-GMP的关键氨基酸

3．1．3 SPR实验检测rLCN2蛋白特异性结合铁载体Fe-Ent／Fe-CMBs

3．1．4 ITC实验检测rLCN2蛋白特异性结合c-di-GMP

3．1．5 ITC热熔变化检测rLCN2蛋白结合c-di-GMP构象变化

3．1．6 ITC实验鉴定rLCN2结合c-di-GMP的关键氨基酸

3．1．7 ITC实验比较c-di-GMP与Fe-Ent／Fe-CMBs竞争性结合rLCN2

3．2 结核分枝杆菌莽草酸激酶AroK是c-di-GMP的直接受体

3．2．1 莽草酸激酶AroK是潜在的c-di-GMP受体

3．2．2 AroK的克隆与表达

3．2．3 AroK能够与c-di-GMP特异性结合

3．2．4 AroK与c-di-GMP结合的关键氨基酸

3．2．5 影响AroK酶活的关键氨基酸位点

3．2．6 C-di-GMP抑制AroK的酶活性

4 总结与讨论

4．1 总结

4．2 讨论

4．2．1 ITC和SPR两种方法结合研究c-di-GMP与其受体相互作用

4．2．2 C-di-GMP和LCN2互作标志着一种全新PAMP／PRR传感机制

4．2．3 AroK可能是结核分枝杆菌中一个新的c-di-GMP受体分子

4．3 展望

参考文献

论文发表情况

致谢