人胸腺和脐血造血干/祖细胞联合移植对裸鼠T细胞免疫功能的影响

摘要

背景与目的：胸腺是人体的中枢免疫器官,是T细胞分化成熟的场所。裸鼠是由于基因突变形成的先天无胸腺无毛小鼠,伴有严重T细胞缺乏和细胞免疫功能缺陷,因此裸鼠在人类肿瘤研究、免疫缺陷、抗感染免疫等方面的研究有较广泛的应用。有研究报道,在适当的条件下,将胸腺组织块或培养的胸腺上皮细胞给免疫缺陷鼠移植,可以重建T细胞功能;也有研究表明,摘除胸腺的小鼠由于免疫功能发生缺陷,易形成肿瘤,经移植胸腺后,抗肿瘤能力增强。其T细胞功能重建和抗肿瘤能力增强的基础必须是移植的胸腺在宿主体内存活,并产生多种胸腺素和细胞因子,重建正常的胸腺环境,通过这些胸腺素和细胞因子促进来自骨髓的淋巴干细胞分化成具有免疫活性的T淋巴细胞,在胸腺发育成熟的T淋巴细胞到达外周免疫器官定居,通过免疫监视功能防止肿瘤的发生,通过细胞毒作用杀伤肿瘤细胞。近年来,血液系统恶性肿瘤、严重的难治性自身免疫病、原发和继发性免疫缺陷病等给人类健康造成极大威胁,重新建立和恢复正常的免疫功能是治愈这些疾病的重要环节和最终目标。本研究采用先天免疫缺陷的裸鼠为研究对象,通过移植人类胸腺组织建立人-鼠动物模型,再通过移植人脐血CD34+细胞,探讨移植胸腺对CD34+细胞分化及裸鼠细胞免疫功能的影响。
　　 方法：
　　 1.胸腺组织移植至裸鼠肾被膜下将裸鼠麻醉,依次切开背部皮肤、肌肉、筋膜,暴露左侧肾脏,将胸腺组织块植入左肾包膜下,逐层缝合。SPF级分笼饲养60d。实验结束时,解剖小鼠观察移植的胸腺组织在小鼠肾脏存活情况,并经免疫组织化学检测CD3分子、HLA-DR分子在移植胸腺的表达情况。
　　 2.脐血单个核细胞分离和CD34+细胞分选取健康产妇自然分娩断脐后的脐静脉血,抗凝。经淋巴细胞分离液离心获得脐血单个核细胞。免疫磁珠法分选出CD34+细胞。台盼兰染色计数活细胞(占95％以上)。流式细胞仪检测CD34+占75％。
　　 3.裸鼠脐血CD34+细胞的移植实验组在胸腺移植2周后,将新鲜分离的脐血CD34+细胞悬液经小鼠静脉输入,每只小鼠输入1×106/mL CD34+细胞0.3 mL,对照组不经胸腺移植直接给予CD34+细胞移植,2组小鼠继续饲养至60d。
　　 4.小鼠免疫功能的检测2组小鼠饲养至60d,每组小鼠中10只进行血液和外周免疫器官T细胞分布和数量观察,另5只进行人胃癌肿瘤细胞系BCG823移植,观察肿瘤生长情况。
　　 5.裸鼠静脉血中人源T细胞及其亚群百分比取小鼠眼底静脉血0.5 mL,裂解红细胞,PBS液洗3次,分别加入FITC-抗人CD3、FITC-抗人CD4、FITC-抗人CD8单抗和PE-抗人CD25单抗,4℃,孵育30 min,PBS漂洗2次。以同种荧光标记的同型抗体作对照。重悬细胞至200μL上流式细胞仪检测。
　　 6.裸鼠脾脏中CD3+T细胞的分布处死小鼠,耿出脾脏,用体积分数10％中性福尔马林液固定,石蜡包埋,切片,HE染色。免疫组化染色操作按试剂盒(S-P法北京中杉公司提供)说明书,进行CD3抗原检测,使用DAB一步法显色剂显色。
　　 7.裸鼠对异种肿瘤细胞的排斥反应将常规传代培养人胃癌BGC823细胞,制成1×107/mL,细胞浓度,每只小鼠右肩部皮下注射肿瘤细胞悬液0.2 mL,观察肿瘤生长,记录肿瘤大小。以肿瘤相互垂直的最大径与2条最小径的乘积(mm3)表示肿瘤大小。
　　 8.统计学处理采用SPSS10.0统计软件分析,计量资料采用均数±标准差(-x±s)表示,采用t检验,计数资料采用x2检验,P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 结果：
　　 1.人胸腺在裸鼠肾被膜下存活及CD3、HLA-DR分子的表达胸腺移植60 d后,处死小鼠解剖可见移植的胸腺在肾被膜下存活,周围无缺血、坏死和炎症;HE染色和免疫组织化学染色可见肾和移植的胸腺组织结构清晰,移植的胸腺组织弥漫表达CD3分子和HLA-DR分子。
　　 2.胸腺和CD34+细胞移植后裸鼠脾脏T细胞的分布胸腺与CD34+细胞联合移植组小鼠脾脏可见点块状分布的CD3+细胞;单独脐血CD34+细胞移植组未见CD3+细胞分布。
　　 3.实验组裸鼠静脉血中人源T细胞及其亚群百分比胸腺和CD34+细胞联合移植组CD3+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞及CD4+CD25+细胞比例均显著高于单独CD34+脐血移植组和空白组。P＜0.054实验组裸鼠对移植人胃癌BGC823细胞的排斥作用胸腺及脐血CD34+细胞联合移植的实验组,接种BGC823细胞后观察15 d未见肿瘤生长,而单独CD34+细胞移植的对照组在接种肿瘤细胞3 d后出现肿瘤块,且逐渐生长、肿瘤块增长迅速。
　　 结论：祼鼠体内移植的人胸腺具有促进人脐血造血干/祖细胞向T细胞分化的功能,联合移植可能是治疗严重免疫缺陷性疾病、促进免疫功能重建的措施,人胸腺-裸鼠模型也可作为研究T细胞分化机制的工具。