基于脂质组学方法的哮喘脂质生物标志物筛选

摘要

哮喘是一种严重危害人类健康的慢性气道炎症疾病，其患病率呈逐年增长的趋势。大部分哮喘患者通过标准化药物治疗可以达到临床症状的控制，但是部分重症哮喘患者即使在积极药物治疗的情况下，症状控制仍不理想。基于表型的个体化治疗是哮喘治疗的新方向，识别特定表型的特征将有助于哮喘的预后评估，且可能有助于个体化治疗方案的选择。但由于哮喘的异质性，一种表型并不能解释所有患者，其治疗并不能使所有哮喘患者获益。生物标志物可以提供有关疾病诊断、预后评估、表型及治疗反应等信息。因此，需进一步研究来发现更多的生物标志物，通过使用合适的生物标志物进行哮喘表型分层，有助于哮喘药物的研发和指导治疗。 研究发现，脂质代谢可能参与哮喘的发病机制。脂质是生物膜的基本组成部分，也是机体的代谢产物，在细胞能量储存、组成结构和信号传导中起关键作用。通过脂质组学分析，可以发现机体疾病状态下异常表达的脂质，可用于疾病生物标志物及发病机制的研究。因此，可以研究哮喘潜在的脂质生物标志物，可能用于寻找新的治疗靶点及指导哮喘的个体化治疗。 目的: 本研究通过超高效液相色谱-电喷雾-质谱（ultra high performance liquid chromatography-electrospray ionisation-mass spectrometry,UHPLC-ESI-MS）的方法对哮喘患者的血浆进行脂质分析，筛选哮喘的潜在脂质生物标志物。 方法: 1、研究对象的收集以2018年7月至2018年12月于郑州大学第一附属呼吸内科门诊确诊的35例哮喘患者（哮喘组）以及32例健康对照者（对照组）为研究对象，采集所有研究对象的血液并分离血浆用以分析，收集年龄、性别、体重指数(body mass index，BMI)等基本信息。 2、血浆丙二醛的检测基于丙二醛(malonaldehyde，MDA)和硫代巴比妥酸反应可以产生红色产物的显色反应，对两组血浆MDA进行定量检测。 3、血浆脂质组学分析通过UHPLC-ESI-MS的方法进行血浆脂质分析，采用LipidSearch software version4.1软件进行峰识别、脂质鉴定、定量等处理，对提取得到的数据进行总峰面积归一化。应用Simca-P14.1软件对经Pareto-caling预处理后的数据进行多变量统计分析及单变量统计分析，多变量统计分析包括主成分分析、偏最小二乘判别分析(partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA)、正交-偏最小二乘判别分析(orthogonal-partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA)，单变量统计分析包括T检验、变异倍数分析，R软件绘制热图。 4、显著性差异脂质的筛选选择同时满足OPLS-DA模型得到的变量投影重要性（variable importance for the projection，VIP）＞1及P＜0.05的脂质作为具有显著性差异的脂质。对显著性差异的脂质进行相关性分析，用SPSS21.0软件绘制显著性差异脂质的受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线，应用Z检验对ROC曲线下面积进行比较。正态分布的计量资料用x±s表示，应用t检验进行比较。P＜0.05差异具有统计学意义。 结果: 1、哮喘组和对照组的年龄、性别、BMI差异均无统计学意义(P＞0.05)。 2、哮喘组血浆MDA含量为（7.75±1.83）μM，高于对照组的（5.28±1.94）μM，差异具有统计学意义(P＜0.05)。 3、PLS-DA模型和OPLS-DA模型可以区分哮喘组和对照组血浆样本，模型未发生过拟合。 4、哮喘组和对照组血浆中共检测到1338种脂质，分别为711种甘油磷脂、350种鞘脂、233种甘油酯、20种脂肪酸、13种甾醇脂、9种糖脂、2种孕烯醇酮脂。 5、哮喘组和对照组血浆中具有16种显著性差异的脂质，分别为PC(18∶1p/18∶2)、PC(16∶0/18∶1)、PC(18∶0/22∶5)、PC(18∶0e/20∶4)、PC(18∶1p/20∶3)、PC(40∶4)、PC(32∶1)、PC(18∶1/22∶5)、PC(18∶0/20∶3)、SM(d20∶0/18∶2)、PS(39∶0)、SM(d18∶1/18∶1)、SM(d18∶0/18∶1)、SM(d22∶1/18∶1)、PE(18∶1/18∶2)、PS(18∶0/20∶4),和对照组相比，哮喘组除PE(18∶1/18∶2)、PS(18∶0/20∶4)水平下调外，其余14种显著性差异脂质水平均上调。 6、显著性差异脂质的相关性分析显示鞘磷脂(SM)和磷脂酰胆碱(PC)之间呈正相关性。 7、在14种上调的显著性差异的脂质中，PC(18∶1p/18∶2)、PC(16∶0/18∶1)、PC(18∶0/22∶5)、PC(18∶0e/20∶4)、PC(18∶1p/20∶3)、PC(40∶4)、PC(32∶1)、PC(18∶1/22∶5)的ROC曲线下面积分别为0.687、0.685、0.677、0.676、0.675、0.664、0.655、0.641，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 结论: 1.哮喘患者存在脂质代谢紊乱，以甘油磷脂和鞘磷脂代谢改变为主。 2.血浆中PC(18∶1p/18∶2)、PC(16∶0/18∶1)、PC(18∶0/22∶5)、PC(18∶0e/20∶4)、PC(18∶1p/20∶3)、PC(40∶4)、PC(32∶1)、PC(18∶1/22∶5)可能成为哮喘的潜在脂质生物标志物。