日本三角涡虫HSP70家族相关基因功能研究

摘要

日本三角涡虫（Dugesia japonica）隶属扁形动物门（Platyhelminthes），涡虫纲(Turbellaria)，在动物系统演化中占有重要地位，并且具有极强的损伤修复及再生能力。但目前，其再生机制并不清楚。本文利用生物信息学、Real-time PCR、原位杂交和RNA干扰等技术对日本三角涡虫转录组中表达量较高的热休克蛋白70家族基因Djhsp70a、Djhsp70b、Djhsp70c、Djhsp70d进行了定量、定位和功能分析。
　　本研究主要内容包括：⑴对四基因进行温度、切割损伤和离子液体应激处理，结果表明:涡虫在培养温度低于或者高于20℃，切割损伤和离子液体处理应激条件下，四基因表达量均明显上调。⑵Djhsp70a生物信息学分析发现:DjHSP70a蛋白是稳定的亲水性蛋白，具有多个磷酸化位点和糖基化位点，含有HSP70家族标签3和末端高度保守的EEVD序列;整体原位杂交结果显示:Djhsp70a基因在整体以及再生涡虫中广泛表达，其中整体涡虫身体两侧有较强杂交信号，再生涡虫芽基处有杂交信号且再生5d和7d时杂交信号最强;Djhsp70a基因干扰后，2/3整体涡虫咽后部膨大，全身皱缩，头部有缺刻，体表开裂，体色加深;3/5再生涡虫的再生速度明显变慢;Real-time PCR检测结果表明:干扰后涡虫Djhsp70a基因，Djpiwi-1，Djpiwi-b，Djh2b的表达量显著下调。说明该基因在涡虫体内干细胞维持、分化和增殖中起重要作用。⑶Djhsp70b生物信息学分析发现:DjHSP70b蛋白是一种亲水性蛋白，包含3个HSP70家族标签序列和末端高度保守的EEVD序列;原位杂交结果显示:Djhsp70b基因在整体涡虫中的头部和身体两侧有较强杂交信号，在再生涡虫芽基处均有较强的杂交信号;Djhsp70b基因干扰后，3/5整体涡虫背侧中线部位发生缺口、咽部发生断裂或者尾部有缺刻，4/5的再生涡虫再生速度变慢;特别是尾再生头片段至再生5d时仍没有出现眼点;Real-time PCR检测表明:干扰后涡虫Djhsp70b和Djpiwi-1两基因的表达量显著下调，说明该基因在涡虫体内在干细胞的维持及组织分化如眼点分化中起重要作用。⑷Djhsp70c生物信息学分析表明:DjHSP70c蛋白是一种亲水性蛋白，包含3个HSP70家族标签序列和末端高度保守的EEVD序列，具有多个磷酸化位点和糖基化位点，是一种稳定的亲水性蛋白;整体原位杂交结果显示:Djhsp70c基因在整体以及再生涡虫中广泛表达，其中在整体涡虫的头部边缘和身体两侧有较强杂交信号，再生涡虫芽基处均有杂交信号;Djhsp70c基因干扰后，7/10整体涡虫咽前和尾部有明显损伤，直到后期损伤部位发生断裂;4/5的涡虫切割后再生停止;Real-time PCR检测表明:干扰后Djhsp70c，Djpiwi-1，Djpiwi-b的表达量显著下调。说明该基因在涡虫体内对于干细胞维持、分化起重要作用，同时在涡虫再生过程中起重要的调控作用，是再生过程所必需的关键调控因子。⑸Djhsp70d生物信息学分析表明:DjHSP70d蛋白是一种亲水性蛋白，具有多个磷酸化位点和糖基化位点，包含热休克蛋白70家族标签3;整体原位杂交结果显示:Djhsp70d基因在整体以及再生涡虫中广泛表达，其中在整体涡虫中的身体两侧，接近表皮有较强杂交信号，再生涡虫的芽基处均有杂交信号且再生5d的芽基杂交信号最强，再生7d信号减弱;Djhsp70d基因RNA干扰后，1/2整体涡虫背部中线出有溃烂，尾部有明显损伤，直到后期损伤部位发生断裂;Real-time PCR检测表明:干扰后Djhsp70d，Djpiwi-1，Djpiwi-b的表达量显著下调。说明该基因参与了涡虫体内干细胞的维持，可能参与涡虫体内蛋白质相关内质网降解途径。

目录

缩略语

摘要

1 引言

1．1 日本三角涡虫概述

1．2 涡虫再生研究进展

1．3 热休克蛋白70的研究进展

1．3．1 热休克蛋白70的分类

1．3．2 HSP70的结构和生物学特征

1．3．3 HSP70的生物学功能

1．4 立题依据与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验材料的采集与培养

2．1．2 实验仪器

2．1．3 实验试剂

2．1．4 实验所用引物

2．2 实验方法与步骤

2．2．1 日本三角涡虫总RNA的提取与检测

2．2．2 一般反转录模板的制备

2．2．6 应激反应过程中四目的基因的表达变化

2．2．7 HSP70家族各目的基因的原位杂交

2．2．8 HSP70家族各目的基因的RNA干扰

3 实验结果

3．1．2 反转录模板cDNA的检测

3．2 热休克蛋白70家族四基因的生物信息学分析

3．2．1 Djhsp70a基因生物信息学分析

3．2．2 Djhsp70b基因生物信息学分析

3．2．3 Djhsp70c基因生物信息学分析

3．2．4 Djhsp70d基因的生物信息学分析

3．2．5 HSP70家族四基因对应蛋白质的同源性和进化分析

3．3 不同应激条件下四基因的表达量变化

3．3．1 不同温度条件处理

3．3．2 切割损伤处理

3．3．3 不同浓度离子液体处理

3．4 HSP70家族四基因的整体原位杂交结果

3．4．2 Djhsp70b基因整体原位杂交结果

3．4．3 Djhsp70c基因整体原位杂交结果

3．4．4 Djhsp70d基因整体原位杂交结果

3．5 四基因RNA干扰结果

3．5．1 Djhsp70a基因RNA干扰结果

3．5．2 Djhsp70b基因RNA干扰结果

3．5．3 Djhsp70c基因RNA干扰结果

3．5．4 Djhsp70d基因RNA干扰结果

4 讨论

4．1 四基因在应激反应中的保护作用

4．2 四基因的结构分析

4．3 四基因的表达及功能分析

5 结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文和参与的课题

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