PI3K/Akt通路在脑创作大鼠神经元损伤中的作用及其与Caspase-8、Bid的关系

摘要

目的:探讨大鼠创伤性脑损伤后P13K/Akt信号通路参与神经细胞保护的作用机制。检测并分析LY294002干预组、DMSO对照组、假手术组中p-Akt、Caspase-8、Bid等指标表达变化情况,为临床上的早期干预和治疗提供新的策略。
　　 方法:应用Marmarou's模型造成大鼠中度弥漫性脑损伤。在砸伤前30min将LY294002经右侧侧脑室注入,DMSO组同样时间仅注射等量的DMSO+PBS。假手术组同样麻醉和切开头皮,但不砸伤。
　　 实验动物及分组:成年雄性SD大鼠184只,体重280±20g,随机分成3组:假手术组(n=42只);DMSO对照组(n=56只);LY294002干预组(n=56)。每组又分为伤后1、3、6h和1、2、3、7d共7个时相点。
　　 检测方法及指标:①神经运动功能评分;②HE染色镜下观察脑组织病理改变;③免疫组织化学方法半定量检测损伤皮质区p-Akt、Caspase-8、Bid的表达情况;④Western-blot法定量检测损伤皮质区p-Akt、Caspase-8、Bid的表达情况。
　　 空间学习记忆功能检测:另取30只大鼠随机分为假手术组、DMSO对照组、LY294002干预组,每组10只,在伤后7到9天进行Morris水迷宫测试。
　　 定量测定:免疫组化图片采用Image Proplus6.0数码医学图像分析系统对图像进行分析测定,结果为积分光密度(IOD/Area)值。Westernblot条带采用Image J图像处理软件进行蛋白定量分析测定,得出条带的灰度值(OD值),最终结果用目标平均灰度值/内参平均灰度值的比值来表示。
　　 统计学分析:采用SPSS16.0 for windows统计软件分析实验数据,实验中所得结果均用-x±s表示,两组样本比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,以P＜0.05表示差异有统计学意义。
　　 结果:
　　 1 形态学观察结果HE染色光镜下显示假手术组大鼠脑组织结构完整,细胞核染成均匀蓝色,形态规则,胞核及核仁清晰可见,胞质呈嗜酸性红染。创伤组不同时间点致伤区大脑皮质出现不同程度的损伤,可见明显的充血及出血灶,血管周围间隙增宽,神经元肿胀,胞浆淡染,染色质边集或凝集,核出现空泡化,细胞周间隙增宽。部分胞核体皱缩,少数神经元坏死。以伤后1d后表现逐渐明显。脑组织病理形态改变LY294002干预组较DMSO对照组加重(Fig.7)。
　　 2 神经运动功能学评分:假手术组大鼠神经功能无异常,评分为24分。DMSO对照组大鼠神经功能评分在15-19分之间;LY294002干预组大鼠神经功能评分在11-15分之间;在LY294002干预组和DMSO对照组大鼠得分均有不同程度降低,分别与假手术组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);IN294002干预组与DMSO对照组比较,神经功能评分更低,差异有统计学意义(P＜0.05)(Fig.1;Tab.1)。
　　 3 p-Akt免疫组化及Western blot检测结果免疫组化结果显示:p-Akt阳性产物为棕黄色颗粒,假手术组偶见微量表达于胞浆,着色浅淡,免疫反应强度不随时间改变。与假手术组比较,DMSO对照组伤后1h表达开始增加,随时间推移阳性细胞逐渐增多,免疫反应性逐渐增强,6h达高峰,持续至1d后表达逐渐降低,阳性产物持续表达至伤后7d。LY294002干预组p-Akt的免疫阳性反应性时程与模型组相似,但免疫反应性明显减弱,差异有统计学意义(P＜0.05)。Western blot蛋白定量结果显示:假手术组仅有微量p-Akt表达,p-Akt蛋白表达量在各时间点无变化;DMSO干预组p-Akt动态表达与免疫组织化学检测结果相吻合。LY294002干预组p-Akt蛋白表达时程与模型组相似,但表达量减少,与其比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。(Fig.2;Fig.8;Tab.2)。
　　 4 Caspase-8免疫组化及Western blot检测结果免疫组化结果显示:Caspase-8阳性产物为棕黄色颗粒,假手术组偶见其微量表达于胞浆,着色浅淡,免疫反应强度不随时间改变。与假手术组比较,DMSO对照组伤后6h表达开始增加,随时间推移阳性细胞逐渐增多,免疫反应性逐渐增强,1d达高峰,持续至2d后表达逐渐降低,阳性产物持续表达至伤后7d。LY294002干预组Caspase-8的免疫阳性反应性时程与模型组相似,但免疫反应性明显增强,差异有统计学意义(P＜0.05)。Western blot蛋白定量结果显示:假手术组仅有微量表达,Caspase-8蛋白表达量在各时间点无变化;DMSO干预组Caspase-8动态表达与免疫组织化学检测结果相吻合。LY294002干预组Caspase-8蛋白表达时程与模型组相似,但表达量减少,与其比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。(Fig.3;Fig.9;Tab.3)。
　　 5 Bid免疫组化及Western blot检测结果免疫组化结果显示:Bid阳性产物为棕黄色颗粒,假手术组偶见其微量表达于胞浆,着色浅淡,免疫反应强度不随时间改变。与假手术组比较,DMSO对照组伤后6h表达开始增加,随时间推移阳性细胞逐渐增多,免疫反应性逐渐增强,1d达高峰,持续至2d后表达逐渐降低,阳性产物持续表达至伤后7d。LY294002干预组Bid的免疫阳性反应性时程与模型组相似,但免疫反应性明显增强,差异有统计学意义(P＜0.05)。Western blot蛋白定量结果显示:假手术组仅有微量表达,Bid蛋白表达量在各时间点无变化;DMSO干预组Bid动态表达与免疫组织化学检测结果相吻合。LY294002干预组Bid蛋白表达时程与模型组相似,但表达量减少,与其比较差异有统计学意义(P＜0.05)。(Fig.4;Fig.10;Tab.4)。
　　 6 空间学习记忆功能检测结果LY294002干预组及DMSO对照组的大鼠在颅脑创伤后第7-10天搜索安全岛潜伏期较假手术组明显延长(P＜0.05)。LY294002干预组的大鼠在颅脑创伤后第7-10天搜索安全岛潜伏期较DMSO对照组明显延长(P＜0.05)。(Fig.5-6;Tab.5)。
　　 结论:
　　 1 脑创伤后PI-3K/Akt通路被激活发挥脑保护作用。
　　 2 p-Akt可以通过抑制Caspase-8、Bid表达,起到保护神经元作用。P13K/Akt信号通路可能通过调控Caspase-8、Bid的表达而发挥脑保护作用。
　　 3 TBI后P13K/Akt信号转导通路激活使伤后大鼠的空间学习记忆功能得到改善。

目录

文摘

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材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 创伤性脑损伤与P13K/Akt信号通路研究进展

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