Sonic Hedgehog及PI3K/Akt信号通路在三甲基氯化锡致神经元损伤中的作用及机制研究

摘要

第一部分 TMT中毒整体动物模型及脑膜片钳技术的建立
　　目的：建立TMT中毒的整体动物体内与脑膜片钳模型，探讨TMT对小鼠的一般毒性作用、神经行为及学习记忆能力的影响。
　　方法：整体动物模型：48只雄性昆明种小鼠随机分为6组，每组8只；分为TMT染毒组：0.25、0.75、1.25 mg/kg和对照组（生理盐水），LBP组（2 g/kg）以及干预组（TMT1.25 mg/kg+LBP2g/kg）。对照组及TMT组每日上午8点腹腔注射连续给药5天；LBP及干预组自TMT染毒前3天预先LBP经口灌胃，直至染毒结束。TMT染毒当晚8点进行一般行为学评分与Racine癫痫评分，共5天；末次给药24 h后断头处死动物，分离脑并计算脑脏器系数；每组4只小鼠各保留一半脑，一半用于免疫组化，另一半与其余4只动物的大脑均分离海马，-80℃冻存备用。脑膜片钳模型：设对照组（生理盐水）和TMT组（1.25 mg/kg），每组3只雄性昆明种小鼠。腹腔注射5天，麻醉后游离海马，检测海马CA1区LTP的改变。
　　结果：（1）小鼠体重及脑脏器系数变化：与对照组相比，1.25 mg/kg组TMT染毒第3天开始体重明显下降（P<0.05），与单独TMT组相比，干预组体重明显高于单独TMT组，第8天体重差异有统计学意义（P<0.05）；与对照组相比，TMT高剂量组及干预组脑脏器系数升高（P<0.01）；（2）一般行为变化：TMT可导致小鼠出现神经系统中毒症状，中剂量和高剂量组自TMT给药第3天至染毒结束均表现出一般中毒症状，症状评分分值升高，第4、5天症状评分持续增长，显著高于对照组（P<0.01）；按Racine癫痫评分，TMT可诱发小鼠癫痫，所有剂量组在TMT染毒初期均无明显症状，癫痫分级在0级，TMT染毒完毕后（第5天），对照组及LBP组所有动物仍为0级，0.25 mg/kg组75％的动物在0级，0.75 mg/kg25%动物在1级，25%动物在2级，其余动物在0级，1.25 mg/kg组所有动物在3级以上，其中12.5%在5级，62.5%为4级；与1.25 mg/kg组相比，干预组中毒症状及癫痫评分均有所下降；（3）学习记忆能力改变：应用海马脑片盲法膜片钳技术，发现TMT可引起小鼠海马CA1区LTP降低，明显低于对照组（P<0.01）。
　　结论：本实验室成功建立TMT中毒小鼠整体动物模型，0.75 mg/kg TMT即能引起小鼠中毒一般症状的发生，并可观察到攻击性、易激惹、轻微震颤等症状；1.25 mg/kg TMT可引起持续性震颤、癫痫发作以及体重降低等明显的神经系统中毒表现。TMT给药前3天预先给予LBP，并持续给药至染毒结束，中毒症状有所减轻，LBP对TMT引起的神经毒性有一定的保护作用。1.25 mg/kg TMT可引起昆明种小鼠海马CA1区长时程增强效应降低，从电生理角度，观察到其对学习记忆功能有影响。
　　第二部分 TMT对小鼠海马神经元损伤的分子生物学机制研究
　　目的：利用整体动物模型研究 TMT对小鼠海马神经元的损伤及其分子生物学机制。
　　方法：尼氏染色及神经元免疫荧光观察神经元损伤；TBA法检测 MDA变化；WST-1法检测SOD的改变；免疫组织化学法检测Sonic Hedgehog变化；Western blot检测Sonic Hedgehog、PI3K/Akt信号通路蛋白及凋亡相关蛋白Bcl2/Bax的改变。
　　结果：（1）神经元损伤：尼氏染色结果可见，中、高剂量组海马各区神经元排列紊乱、细胞数量减少、间隙变大、细胞肿胀、尼氏小体减少；免疫荧光结果显示：中剂量组小鼠海马DG区即受损、神经元缺失，高剂量组海马各区神经元均出现缺失；LBP可减轻TMT诱导的海马神经元损伤。（2）TMT对小鼠海马神经元凋亡相关蛋白的影响：与对照组相比，各 TMT剂量组海马神经元的Bcl-2表达水平下降，而 Bax表达水平升高。与TMT组相比，干预组Bcl-2蛋白表达升高，Bax表达减少，差异有统计学意义（P<0.05）；（3）MDA及SOD结果显示，随着TMT染毒剂量的升高，海马MDA水平呈上升趋势，与对照组相比，中剂量组和高剂量组及干预组差异有统计学意义（P<0.05）；与对照组相比，海马SOD水平随着TMT染毒浓度的升高而降低，高剂量组差异有统计学意义，与1.25 mg/kg TMT组相比，干预组SOD表达升高，差异有统计学意义（P<0.05）；（4）Sonic Hedgehog蛋白表达变化：中、高剂量组海马CA区Shh蛋白明显减少，表现为棕黄色颗粒物减少；（5）蛋白免疫印迹法检测小鼠海马Sonic Hedgehog与PI3K/Akt信号通路蛋白表达的变化：与对照组相比，TMT低剂量和中剂量组Shh蛋白表达水平降低，高剂量组上升，总Akt及总GSK-3β水平各组之间无明显差异，p-Akt及 p-GSK-3β表达随着染毒剂量的增加而降低；与1.25 mg/kgTMT组相比，干预组Shh、p-Akt及p-GSK-3β表达升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。
　　结论：TMT在整体动物模型中，可引起神经元尼氏体的丢失，神经元损伤及缺失，利用尼氏染色和免疫荧光方法证实TMT神经损伤的细胞水平物质基础；发现TMT可造成细胞凋亡和氧化应激的异常，其分子生物学机制涉及Sonic Hedgehog信号通路的抑制，表现为关键蛋白Shh及Gli1表达的降低；PI3K/Akt信号通路的抑制，体现为该通路关键蛋白p-Akt的抑制与GSK-3β的活化；脂质过氧化反应的发生等。
　　第三部分 Sonic Hedgehog与PI3K/Akt信号通路在TMT致N2a细胞凋亡模型中的作用
　　目的：建立 TMT中毒的体外神经细胞模型，确认 Sonic Hedgehog与 PI3K/Akt信号通路是否参与介导TMT引起的N2a细胞凋亡，并探讨LBP对TMT神经毒作用的保护作用。
　　方法：MTT法测定细胞存活率；Hoechst染色观察细胞凋亡；流式细胞术检测细胞凋亡；ELISA法检测caspase-3的变化；DCFH-DA法检测ROS的改变；TBA法检测MDA的变化；WST-1法检测SOD的改变；WB检测Sonic Hedgehog与PI3K/Akt信号通路及Bcl-2、Bax等蛋白的改变； RT-PCR检测Sonic Hedgehog与PI3K/Akt信号通路相关mRNA的表达。
　　结果：（1）TMT对N2a细胞存活率的影响：与正常对照组相比，3.75及7.5μmol/L TMT作用24 h，细胞存活率明显下降（P<0.05），并具有剂量反应关系；形态学观察，3.75μmol/L与7.5μmol/L TMT作用24 h后，细胞数目明显减少，突触回缩，细胞贴壁能力减弱，呈球状漂浮；（2）TMT对 N2a细胞凋亡的影响：与正常对照组相比，3.75μmol/L与7.5μmol/L TMT作用24 h，细胞早期凋亡率和晚期凋亡率均明显增加（P<0.01）；Hoechst33258染色可见3.75μmol/L与7.5μmol/L TMT作用24 h可使染色体聚集，DNA裂解；Western blot对Bcl-2与Bax蛋白表达进行定量分析，结果显示，随着染毒剂量增加，Bcl-2蛋白表达显著降低（P<0.05），而Bax蛋白水平显著增加（P<0.01）；（3）caspase级联反应活化：3.75μmol/L与7.5μmol/L TMT作用24 h可使caspase-9 mRNA表达与caspase-3表达显著升高（P<0.05），LBP可降低caspase的活化（P<0.05）；（4）氧化应激反应的发生：与对照组相比，TMT染毒24 h使得ROS与MDA表达水平升高，SOD表达降低。与TMT组相比，LBP可降低ROS与MDA，并使SOD升高（P<0.05）；（5）Sonic Hedgehog及PI3K/Ak信号通路抑制：随着TMT染毒剂量的增加，作用24 h后Shh与Gli1蛋白及Smo mRNA表达降低，Ptch及Sufu的mRNA表达升高（P<0.05）；Akt与GSK-3β磷酸化蛋白及PDK1 mRNA表达显著降低（P<0.05）；而各剂量组TMT对总Akt及GSK-3β蛋白表达变化无明显影响；两条信号通路下游蛋白C-Myc与Cyclin D表达减少（P<0.05）。与3.75μmol/L TMT组相比，LBP对以上指标的改变均有保护作用（P<0.05）。
　　结论：本试验选择N2a细胞为实验模型，TMT染毒剂量为1.875，3.75，7.5μmol/L，LBP给药浓度为300μg/mL，染毒时间为24 h，以细胞凋亡和氧化应激为最终毒性指标，呈现出良好的剂量-毒效应关系。以此为信号通路的研究模型，发现可引起 N2a细胞发生凋亡，氧化损伤作用，同时抑制Sonic Hedgehog与PI3K/Ak信号通路，表现为 Sonic Hedgehog通路蛋白 Shh与 Gli1表达的减少及 PI3K/Akt通路蛋白 Akt及GSK-3β磷酸化程度的降低。LBP对TMT诱导产生的神经元损伤具有保护作用。提示细胞凋亡、氧化损伤、Sonic Hedgehog及PI3K/Akt信号通路的抑制可能参与TMT的神经毒作用机制。
　　第四部分 TMT致N2a细胞损伤模型中Sonic Hedgehog与PI3K/Akt信号通路的“Crosstalk”
　　目的：以两条信号通路的特异性抑制剂为工具，进一步从蛋白及RNA表达层面研究TMT致N2a细胞凋亡模型中Sonic Hedgehog与PI3K/Akt信号通路的“Cross-talk”，GSK-3β在其中扮演的角色及氧化应激与两条信号通路的关系，并观察各抑制剂对TMT致N2a细胞凋亡的影响，以探讨其毒性途径。
　　方法： LY294002预处理N2a细胞1 h，GDC-0449预处理细胞2 h后，TMT染毒24 h，MTT检测细胞存活率改变；流式细胞术分析各抑制剂对TMT导致的细胞凋亡的影响；RT-PCR检测 caspase-9 mRNA改变，ELISA法检测 caspase-3的变化；DCFH-DA法检测ROS的改变，TBA法检测MDA的变化；WST-1法检测SOD的改变；RT-PCR检测Sonic Hedgehog与PI3K/Akt信号通路相关mRNA的表达，Western blot检测通路相关蛋白表达变化。
　　结果：（1）抑制剂对细胞存活率的影响：与TMT单独染毒组相比，Sonic Hedgehog通路抑制剂GDC-0449与PI3K/Akt通路抑制剂LY294002预处理并染毒后细胞存活率降低（P<0.05）；细胞回缩，变圆，细胞数量减少。
　　（2）抑制剂对细胞凋亡的影响：Sonic Hedgehog通路抑制剂GDC-0449与PI3K/Akt通路抑制剂LY294002预处理细胞后再进行TMT染毒，细胞总凋亡率显著高于TMT单独染毒组，其中LY294002预处理，晚期凋亡率高于单独TMT染毒组（P<0.01）。抑制剂预处理可使caspase-9 mRNA及caspase-3的表达水平升高（P<0.01）。
　　（3）抑制剂对氧化应激的影响：与单独 TMT染毒组相比，10μmol/L PI3K/Akt通路抑制剂LY294002预处理或30μmol/L Hedgehog通路特异性抑制剂GDC-0449预处理，均可使细胞 ROS荧光强度增加，表达升高（P<0.01）；MDA表达水平上升（P<0.01）；SOD表达水平降低（P<0.01）。
　　（4）PI3K/Akt信号通路：与TMT单独染毒组相比，10μmol/L PI3K/Akt通路抑制剂LY294002预处理1 h，可使磷酸化GSK-3β表达降低（P<0.01）；Ptch、Sufu的mRNA表达升高（P<0.01）；Smo、PDK1的mRNA及 Shh、Gli1的蛋白水平降低（P<0.01）。
　　（5）Sonic Hedgehog信号通路：与TMT单独染毒组相比，30μmol/L Hedgehog通路抑制剂GDC-0449预处理2 h可使磷酸化Akt及磷酸化GSK-3β表达降低（P<0.05）；PDK1的mRNA表达降低（P<0.05），Sufu的mRNA表达升高（P<0.01）。
　　结论：在TMT致细胞凋亡模型中，Sonic Hedgehog与PI3K/Akt信号通路的抑制可促使细胞凋亡率增加，caspase-9及caspase-3表达升高，具有促进细胞凋亡的作用，并能诱导氧化应激反应的发生。与单一信号通路研究相比，对信号通路之间联系的研究更切合实际。途径研究表明两条信号通路间存在“Cross-talk”：Sonic Hedgehog与PI3K/Akt信号通路相互抑制，其中，GSK-3β可能在两条通路之间起到桥梁作用；同时两信号通路与氧化应激之间存在双向调节。两信号通路间与氧化应激的相互调节，最终结局为TMT使caspase家族活化，导致凋亡发生。

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全文缩写词（Abbreviation）

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英文摘要

前言

1 研究背景

2 研究内容

第一部分 TMT中毒整体动物模型及脑膜片钳技术的建立

材料与方法

结果

讨论

第二部分 TMT对小鼠海马神经元损伤的分子生物学机制研究

材料与方法

结果

讨论

第三部分 Sonic Hedgehog与PI3K/Akt信号通路在TMT致N2a细胞凋亡模型中的作用

材料与方法

结果

讨论

第四部分 TMT致N2a细胞损伤模型中Sonic Hedgehog与PI3K/Akt信号通路的“Cross-talk”

材料与方法

结果

讨论

小结

本研究的创新之处：

本研究的不足及有待深入研究的地方：

参考文献

综述: 神经毒理学中Hedgehog信号通路研究进展

附录

致谢