禽网状内皮组织增生症病毒env基因蛋白抗原的表达及其检测应用

摘要

禽网状内皮组织增生病(RE)是由网状内皮组织增生症病毒(REV)引起的一种禽类重要的肿瘤性疾病，目前在我国的流行和危害越来越严重。该病直接导致禽死亡虽然并不常见，但感染禽表现生长迟缓、免疫抑制，降低疫苗接种的免疫应答而导致免疫失败和降低鸡体对疾病的抵抗力，导致禽群的淘汰率和死亡率升高，进而给养禽业带来很大的经济损失。为了建立ELISA等快速、特异、简便的诊断技术，表达REV的囊膜糖蛋白env基因作为抗原并研制其相应的抗体是十分必要的，对该病的防控具有重要的现实意义。 根据已发表的REV毒株鸭脾坏死病(SNV)的序列，设计并合成一对引物，以SNV前病毒cDNA全基因组克隆为模板，通过PCR技术，扩增出该病毒的囊膜糖蛋白env基因的整个开放阅读框(ORF)；将PCR产物按正确的阅读框架定向克隆进pGEX-6P-1载体中谷光甘肽-S-转移酶(GST)的下游，将重组质粒转化进宿主菌BL21中，在1.0 mmol/L IPTG的诱导下，env基因以融合蛋白的形式获得了良好的表达，表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，证实其表达的融合蛋白的大小为72kD；Western-Blot和ELISA检测结果表明，纯化的pGEX-6P-1-env重组融合蛋白抗原与REV标准阳性血清呈现良好的反应性。 将表达产物回收后免疫小鼠，所得的抗血清可与SNV感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)在免疫荧光试验(FA)呈阳性反应。这表明，体外表达的重组融合蛋白具有很好的免疫原性，而且保留了天然蛋白所具有的抗原性。 以纯化后的pGEX-6P-1-env重组融合蛋白为包被抗原,建立了检测REV抗体的间接ELISA方法。经条件优化，抗原的最佳包被浓度为0.2μg/孔。以建立的方法及条件对8份鸡血清进行了初步的应用检测，结果表明反应具有很好的特异性和敏感性。 本课题研究的结果表明，成功构建并原核表达的囊膜糖蛋白env基因的重组融合蛋白抗原以及建立的ELISA技术，为REV感染的诊断和疫苗免疫后抗体效价的监测提供了一种有用的工具。

目录

文摘

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声明

引 言

第一章文献综述

1.1流行现状

1.2病原学

1.2.1分类

1.2.2形态学及化学组成

1.2.3稳定性

1.2.4复制

1.2.5宿主范围

1.3流行病学

1.3.1病毒的传播

1.4发病机理

1.5 REV引起免疫抑制的机理

1.6临床及病理变化

1.6.1病理变化

1.6.2矮小综合征

1.6.3慢性瘤形成

1.7诊断

1.7.1病毒分离与鉴定

1.7.2血清学检测

1.7.3鉴别诊断

1.8禽类免疫抑制病与REV、MDV、ALV-J共感染

1.8.1禽类免疫系统和免疫抑制

1.8.2 REV、ALV-J共感染研究概况

1.8.3 REV和MDV的共感染

1.8.4 REV和MDV病毒重组

1.9预防和控制

1.10本研究的目的和意义

第二章禽网状内皮组织增生症病毒env基因的原核表达及蛋白蛋白产物的鉴定

2.1材料与方法

2.1.1质粒和菌株

2.1.2主要试剂

2.1.3主要仪器

2.1.4所用溶液及其配制

2.1.5引物的设计

2.1.6 PCR扩增env基因片段

2.1.7 PCR产物的纯化与回收

2.1.8双酶切

2.1.9 env基因扩增片段的克隆

2.1.10重组质粒DNA的酶切鉴定

2.1.11阳性克隆插入片段的序列测定

2.1.12重组质粒的诱导表达

2.1.13表达产物的纯化

2.1.14菌体裂解物的SDS-PAGE电泳

2.1.15重组蛋白的Western-blot分析

2.2结果

2.2.1 erv基因的扩增及克隆鉴定的结果

2.2.2重组质粒酶切鉴定的结果

2.2.3重组克隆的测序结果

2.2.4表达产物SDS-PAGE分析的结果

2.2.5Westem blot分析的结果

2.3讨论与小结

第三章REV-env基因重组表达蛋白抗原的检测及应用

3.1材料与方法

3.1.1毒株与单克隆抗体

3.1.2实验用鸡胚及免疫小鼠

3.1.3主要试剂

3.1.4重组蛋白抗血清的制备

3.1.5制备的抗体对REV毒株感染细胞的检测

3.1.6鼠抗血清效价的测定

3.1.7间接ELISA技术的建立及检测应用

3.1.8间接ELISA的特异性试验

3.2结果

3.2.1制备的抗体对REV毒株感染细胞检测的结果

3.2.2鼠抗血清效价测定结果

3.2.3间接ELISA应用检测的结果

3.2.4间接ELISA特异性检测的结果

3.3讨论与小结

第四章结论与讨论

参考文献

致谢

个人简历

攻读硕士学位期间所发表的学术论文及参与的科研课题

附录：符号及缩略词