表达禽网状内皮组织增殖病病毒env蛋白的重组马立克病毒的构建及鉴定

摘要

禽网状内皮组织增殖病(Reticuloendotheliosis,RE)是由禽网状内皮组织增殖病病毒(Reticuloendothelio-sis Virus,REV)引起禽免疫抑制、致死性网状细胞瘤、生长抑制等综合征的免疫抑制病.本研究基于马立克病毒(Marek's disease virus,MDV)meq基因缺失株SC9-1利用同源重组技术构建表达REV env蛋白的重组MDV.首先,利用高保真taq酶扩增REV env基因,酶切后克隆进真核表达载体pcDNA3.1中,经酶切测序鉴定后,提取阳性重组质粒转染进鸡胚成纤维细胞(chick embryo fibroblast,CEF).以REV单克隆抗体11B118作为一抗对转染重组质粒CEF细胞进行间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)鉴定.其次,以鉴定阳性的重组质粒作为模板扩增表达REV env的表达盒,与卡那霉素抗性基因拼接克隆进pUC18载体.以MDV SC9-1meq基因前后各50bp碱基作为同源臂扩增REV env的表达盒以及卡那霉素抗性基因,利用Red E/T同源重组插入SC9-1基因组的meq基因.最终,大量提取经测序鉴定阳性的重组质粒利用磷酸钙转染进CEF细胞,拯救重组MDV,待出现MDV典型蚀斑后,以REV单克隆抗体11B118作为一抗进行IFA鉴定.结果显示,REV env基因能够在真核表达载体pcDNA3.1成功表达.以MDV SC9-1传染性克隆作为载体构建的重组质粒转染进CEF细胞6天后出现MDV特有的细胞病变,以11B118作为一抗经IFA鉴定,显示特异性的亮绿色荧光.综上,以pcDNA3.1载体中cmv启动子构建的表达REV env蛋白的表达盒能够在MDV SC9-1基因组中稳定表达REV env蛋白,构建的重组病毒在CEF细胞上的复制水平没有显著变化,在细胞上传代10代仍然能够稳定表达REV env蛋白.为今后利用MDV SC9-1构建重组载体疫苗提供参考.