肺癌细胞中NGAL基因的基础表达调控机制

摘要

NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)基因的蛋白表达产物是1993年是由Kjeldsen等人在中性粒细胞中首先发现的。有关NGAL基因在各种组织中的表达及其生物学功能一度成为人们研究的热点。近年来越来越多的研究表明,NGAL基因在肿瘤组织中不仅呈现高表达,而且还参与癌细胞的侵袭与不良分化。但是关于NGAL基因的表达调控机制目前尚不甚明了。针对于此,我们在肺癌细胞系中深入研究了NGAL基因的基础表达调控机制。这将有助于从分子水平上促进肺癌发生发展机制的研究;同时也会对研究NGAL基因在其它肿瘤细胞中的表达调控机制具有指导意义。
　　研究内容和方法:
　　1.运用免疫组织化学技术对肺腺癌、鳞癌、肺泡癌等23例肺癌组织切片中NGAL基因的表达情况进行检测分析。
　　2.利用RT-PCR和免疫荧光的方法,分别在RNA和蛋白水平检测NGAL基因在肺癌细胞系95D和A549细胞中的表达情况。
　　3.运用PCR缺失、突变及定点突变的方法构建一系列NGAL基因的荧光素酶报告基因表达载体,然后进行瞬时转染,检测在关键调控元件缺失或突变之后的相对荧光素酶活力,确定NGAL基因的核心启动子区。
　　4.应用生物信息学方法预测与NGAL基因核心启动子区相互作用的潜在的转录因子。
　　5.运用蛋白印迹技术检测NGAL基因的潜在的转录因子在上述两种肺癌细胞系中的表达情况。
　　6.设计、合成寡核苷酸探针,利用凝胶滞留技术研究确定 NGAL基因启动子区调控元件与肺癌细胞核蛋白的结合情况;利用凝胶超滞留技术研究确定肺癌细胞中与 NGAL基因启动子区调控元件具有结合能力的转录因子。
　　研究结果:
　　1.免疫组化检测结果表明,肺癌组织中NGAL阳性着色的比例为82.61％(19/23)。肺腺癌、鳞癌组织细胞中可见NGAL中等强度的阳性着色分布于整个细胞胞浆。提示在肺癌组织中有NGAL基因的显著表达。
　　2.RT-PCR和免疫荧光检测发现,在肺癌细胞系95D和A549细胞中存在着NGAL基因的表达。
　　3.构建了一系列的NGAL基因的报告基因表达载体。检测结果表明,NGAL基因在肺癌细胞系中的核心启动子区为-152~-141,而-106~-79区间是NGAL基因的最小功能启动子区。
　　4.生物信息学预测显示,与NGAL基因-152~-141区段相结合的转录因子可能是C/EBPs(CCAAT/enhancer binding proteins)家族成员;而与NGAL基因-106~-79区段相结合的可能是MRFs(Myogenic Regulatory Factors)家族成员。
　　5.进一步的蛋白印迹技术检测发现,在肺癌细胞系中仅有上述两个家族中的C/EBPβ和MyoD、Myf5的表达。
　　6.凝胶滞留实验发现,在肺癌细胞的核蛋白中确实存在着能够与NGAL基因调控序列相结合的成分。进一步的超滞留实验结果表明,与NGAL基因调控序列结合的转录因子分别是C/EBPβ和MyoD。
　　结论:在肺癌细胞中,调控NGAL基因表达的核心启动子区以及最小功能启动子区分别位于其转录起始位点上游-152~-141和-106~-79区间。C/EBPβ和MyoD可能是调控NGAL基因基础表达的关键转录因子。NGAL基因在肺癌细胞中的表达调控特点与其它肿瘤细胞的明显不同,提示NGAL基因的表达调节存在细胞特异性。

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中文摘要

英文摘要

目录

1前 言

2 材料与方法

2.1 主要实验试剂和材料

2.2 质粒与菌株

2.3 仪器与设备

2.4 技术路线

2.5 实验方法

3 结 果

3.1 NGAL在肺癌组织中的表达

3.2 NGAL在肺癌细胞中的表达

3.3 pGLB系列突变子的鉴定

3.4 NGAL基因启动子区在95D和A549细胞中的基础转录活性

3.5 NGAL基因的核心启动子区位于-152～-141区间

3.6 C/EBPβ可能是调控NGAL基础表达的转录调节因子

3.7 NGAL基因的最小功能启动子区位于-106～-79区间

3.8 MyoD可能是另一个调控NGAL基础表达的转录调节因子

4 讨 论

小结

问题与展望

参考文献

结果图示

文献综述：

附录1 试剂配制

附录2载体图

附录3硕士研究生期间发表论文

致谢