蚊性别决定的分子机制及重组蚊浓核病毒的杀虫效果测试

摘要

第一部分：
　　 研究背景:蚊媒传染病是以蚊虫为媒介传播的疾病，包括疟疾、丝虫病、登革热、流行性乙型脑炎、黄热病等。蚊媒病流行范围广，传播力强，发病率高，全球每年有上亿人感染疟疾、登革热等蚊媒病，死亡人数过百万。媒介蚊虫防制是控制蚊媒传染病流行的重要措施。目前，对于登革热、黄热病、西尼罗病毒病等蚊媒性病毒传染病尚无特效治疗方法或特异性预防手段，而疟原虫对传统药物抗药性也逐渐凸显，媒介控制在预防其发生和流行方面的重要性就显得更加突出，而寻求有效的控制方法则成为世界医学界面临的重要课题。虽然媒介化学防制由于其突出的效果在蚊媒防制中一直占有统治地位，但是化学农药所造成严重的环境污染，易引起蚊虫药物抗性产生等弊端日益显现，蚊虫的生物防制愈来愈受到人们的青睐。生物防制主要应用蚊虫病原体、寄生物、捕食物来达到防治效果，对非目标生物和有益生物无害，不污染环境，蚊虫对其不易产生抗性。近年，苏云金芽孢杆菌、杆状病毒，虹彩病毒等多种蚊虫病原体相继直接或通过基因工程改造加强其致病性和毒力后应用于蚊虫防制实验中，而近来随着一系列新的蚊类特有病毒蚊浓核病毒(Mosquito densoviruses，MDV)在国内外不断被发现与深入研究，其病原学与分子生物学特征使其具有蚊虫防制的潜在价值以及其它种类病原不能比拟的优势，发展MDV为新型蚊类生物杀虫剂将为蚊媒传染病生物防制提供了一个崭新方向。
　　 MDVs属细小病毒科(Parvovirinae)，可特异性感染蚊类的病原，感染蚊类后引起宿主特征性的细胞核致密增生病变(Densonucleosis)，严重时导致宿主发病甚至死亡。人们相继从多种实验室蚊细胞系/实验室株以及自然界中的埃及伊蚊、白纹伊蚊、微小按蚊等蚊类中相继分离到该类病毒。
　　 MDVs为单链DNA病毒，基因组长大约4000nt左右，目前多种MDVs的全病毒基因组已克隆入质粒载体，在大肠杆菌中得以扩增，从而简化了病毒的亚克隆改造过程。病毒质粒转化蚊类细胞如C6/36后，表达非结构蛋白可以特异识别病毒基因组两端IRS序列并将基因组从质粒上切割下，进而大量复制与包装，完全恢复野生型性状而达到病毒的自我拯救作用。
　　 MDV的病原学特点吸引人们利用野生病毒作为杀虫剂进行了相关实验并暴露出一些野生病毒的常见问题，例如:杀虫活性低，作用速度慢等。通过基因工程改造病原体使之表达影响昆虫正常生理代谢的酶、激素或作用于昆虫的毒素蛋白则是解决这些问题的有效途径。昆虫特异性神经毒素是一类作用于昆虫神经系统，有毒杀作用的蛋白类神经毒素，由蝎子、蜘蛛、胡蜂、蚂蚁等捕食性动物毒腺分泌的毒液纯化而来。已有多种蝎毒基因在转基因植物中表达并用于害虫防制，在昆虫杆状病毒、绿僵菌等病原体中表达后有效地增加了杀伤效果。
　　 目的:本研究拟以埃及伊蚊浓核病毒(Aedes aegypti densovirus，AeDNV)为载体，表达昆蝎类昆虫特异性神经毒素BmKIT，通过实验室测试重组病毒的杀伤效果，从而为新型蚊类特异性生物杀虫剂的开发奠定基础。
　　 方法:根据已报道的东亚钳蝎昆虫特异性神经毒素(Buthus martensii Karsch insect toxin, BmK IT)的cDNA序列合成全长cDNA（包括其N端信号肽序列与末尾终止序列）。埃及伊蚊浓核病毒AeDNV全基因组已克隆入载体质粒pUC19构建成质粒pUCA，将蝎毒基因BmKIT克隆到pUCA质粒AeaDNA非结构蛋白启动子p7之后，与非结构蛋白NS1融合表达，从而构建质粒pUCA-AIT。载体pUCA-AIT与pUCA共转染蚊C6/36细胞系。获得重组病毒颗粒后感染白纹伊蚊幼虫，RT-PCR检测蝎毒基因是否在C6/36细胞和白纹伊蚊中转录。Western-blot验证蝎毒基因是否表达。将实验室不同发育阶段的白纹伊蚊幼虫暴露在不同浓度的重组病毒颗粒下，以野生病毒颗粒为对照。于不同时段记录各组幼虫死亡情况，对比评价各种重组病毒的杀虫效果。
　　 结果:RT-PCR与Western-blot结果证实蝎毒基因可在C6/36细胞和白纹伊蚊活体内转录和表达。可表达蝎毒蛋白的重组蚊浓核病毒对白纹伊蚊致死率明显高于野生病毒，其半数致死量LD50低于野生病毒，半数致死时间LT50短于野生型，此外其对蚊虫的亚致死效应也优于野生病毒。
　　 结论:畜安全、高效、选择性强是生物杀虫剂开发的目标，通过基因工程改造的病毒作为生物害虫杀虫剂具有广阔的发展前景。以埃及伊蚊浓核病毒AeaDNV为载体系统，表达蝎类昆虫特异性神经毒素BmKIT有效的强化病毒杀伤效果，为发展重组蚊浓核病毒生物杀虫剂提供了理论基础。
　　 第二部分：
　　 研究背景:
　　 蚊媒传染病无论在世界范围还是在我国仍然是重要的公共卫生问题，它们的流行严重危害人类生命健康，影响社会的稳定，阻碍经济的发展。目前，蚊媒病毒传染病如:登革热、黄热病、西尼罗病毒病等尚无特效治疗方法或有效疫苗来预防。而疟原虫也开始对多种传统药物出现抗药性，并迅速蔓延扩散，甚至对氯喹、青蒿素等多种主要抗疟药物出现耐药，以致WHO建议所有国家禁止销售口服青蒿素单一疗法药物。对于这些缺少疫苗、临床尚无有效治疗方法、寄生虫抗药性问题凸显的蚊媒传染病，媒介控制成为控制蚊媒传染病流行的重要措施，在预防蚊媒传染病发生、流行等方面起到关键的作用。
　　 化学防制由于其突出的效果一直在蚊媒防制中起到关键的作用，但是化学杀虫剂例如有机氯、有机磷等农药易造成严重的环境污染，影响人畜健康，威胁非靶昆虫的生存，乃至引起生态平衡失调。此外，蚊类对包括拟除虫菊酯在内的三代杀虫剂也出现耐药性或交叉耐药性。在非洲以及亚洲部分地区甚至出现对所有种类杀虫剂耐药的蚊种。因此，寻求更有效的媒介控制方法则成为世界医学界面临的重要课题。
　　 昆虫不育技术(Sterile insect technique，SIT)是利用遗传学的方法防制害虫，其优点是不会向外界释放新物种，不会污染环境，引起害虫抗药性等问题，而且其对有害生物的防控效果迅速。目前这一技术应用取得了瞩目的成就，例如在美国、墨西哥、中美洲大部分地区以及利比亚已经根除新大陆螺旋蝇(New World Screwworm)—一种攻击牛、骆驼以及其它牲畜和野生动物身上任何小伤口的食肉蝇。在Zanzibar岛大部分地区亦已根除了传染人畜锥体寄生虫的采采蝇(Tsetse fly)，大大减少了锥虫病对人、畜的威胁及其危险性。日本、美国、墨西哥、伯利兹、危地马拉、智利、巴勒斯坦、约旦、以色列、澳大利亚和南非已根除了地中海果蝇(Ceratitis capitata)和其它果蝇等影响贸易的主要害虫。粮农组织和国际原子能机构合办的粮食和农业核技术计划已成为昆虫不育技术应用的全球领导中心。未来计划包括在南美洲防制新大陆螺旋蝇，以及在加拿大等地区防制苹果蠹蛾(Coddling moth)和其它园艺作物毛虫。
　　 但是，SIT在蚊虫防制上的应用进展就显得相对缓慢。由于释放过程中即使少量的雌性必将带来相反的后果与社会反应，所以必须需要高效且低成本的性别分离系统(Sex separation system)，从而保证向野外释放的都是单一雄性个体。目前常用的性别分离方法如机械法分离法等不能满足这种要求。
　　 RIDL(Release of Insects carrying a Dominant Lethal)技术，主要通过转基因技术使蚊虫携带显性致死基因，这种致死性基因多为雌性特异性表达并通常通过一定的物理条件进行控制，一旦这种物理条件改变，引起致死性基因表达，雌性将特异性死亡。例如利用卵黄蛋白(Yolk protein Yp3)雌性特异启动子联合四环素(tetracycline，Tet)调控表达系统特异性的在雌性脂肪体内表达四环素阻遏的转录激活因子元件(Tetracycline-repressible transactivator fusion protein，tTa)在食物中施加四环素的时候，四环素作用于该元件，阻止该元件与tet operator sequence(tetO;or tet response element，TRE)结合从而阻遏相关毒性蛋白的表达。在缺乏四环素的条件下，毒性基因表达并作用于雌性个体，使之死亡。RIDL技术允许多种特异性调节性致死性基因表达框插入，从而协同增加RIDL的效果。
　　 在昆虫中性别决定是通过一系列复杂的基因调控网络来实现的，这个调控网络顶端的基因起到决定性的作用，不同种类的昆虫这种顶部起始基因是大相径庭的，例如在黑腹果蝇中，这个顶端的因素是果蝇X染色体的量。尽管调控网络的起始基因物种之间差异很大，但是位于调控网络底部的基因却是相对保守的，例如transformer(tra)基因与doublesex(dsx)基因以及transformer2(tra2)基因。这些基因在多种昆虫中均发现，且起到性别调控的作用。例如在黑腹果蝇中，tra基因受到Sex-lethal(sxl)基因调控，pre-mRNA通过性别特异性选择性拼接(Sex specific alternative splicing)，只在雌性中出现功能性的tra，功能性的tra继续调节下游dsx基因的表达，也通过性别特异性选择性拼接，dsx在雌性中拼接为功能性的female dsx(dsxF)，在雄性中形成male dsx(dsxM)。RIDL技术中例如四环素阻遏的转录激活因子元件的表达，目前要求使用雌性特异性的启动子，但是由于物种间的差异性，这种果蝇内源性的启动子表达系统不能广泛移植于其它物种。而性别特异性选择性拼接基因此时就成为另一种可选择的策略，由于该类型基因功能保守性强，容易分离鉴定，所以其成为应用于改进RIDL的最佳策略。
　　 目前主要媒介蚊种包括冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)、致倦库蚊(Culexquinquefasciatus)、斯氏按蚊(Anopheles stephensi)全基因组与转录组测序完成，使用生物信息学寻找蚊虫性别调控基因成为可能。但是目前已经过分离鉴定的蚊虫性别基因只包括sxl、dsx等基因。蚊虫中的sxl基因，其在雌、雄体内无性别特异性表达。但下游dsx基因在冈比亚按蚊与埃及伊蚊中已经分离鉴定，其结构相对保守，性别特异性拼接特征也相对保守。本研究将对主要媒介蚊种的tra2基因进行分离鉴定，对tra2基因在蚊虫性别决定中的角色进行初步分析，此外对不同蚊种的dsx基因进行比较，对dsx序列应用于蚊虫性别分离的可行性进行初步测试。
　　 目的:主要媒介蚊种的tra2基因进行分析、分离与鉴定，对An.stephensi tra2基因的功能进行初步分析。对An.stephensi tra2基因对下游基因dsx、fruitless、vitellogenin的调控，以及最终对雌性成蚊血餐后卵巢发育的影响进行研究。
　　 方法:通过生物信息方法，利用vectorbase数据库，使用D.melanogastertra2进行BLASTn比对，寻找Ae.aegypti、Cu.quinquefasciatus、An.stephensi三种蚊的tra2基因，利用相应基因特异性引物通过RT-PCR以及RACE方法获得基因全长。使用生物信息学方法对获得的各种蚊类tra2基因以及蛋白进行比对分析，绘制蛋白质进化树对其生物进化进行分析。使用RT-PCR以及qPCR的方法对tra2基因的时间特异性表达，与组织特异性表达进行分析。
　　 通过显微注射的方法，利用siRNA对蚊虫的成虫以及蚊卵中的tra2基因进行基因表达沉默，利用RT-PCR或qPCR的方法研究tra2基因的表达抑制对其下游dsx基因的性别特异性拼接的影响。以及tra2基因的表达抑制在成蚊中对其下游fru性别特异性拼接的影响。同时研究tra2基因的表达抑制对雌性特异性基因vg，在蚊虫血餐后的表达影响，及其对雌性成蚊卵巢发育的影响。
　　 结果:通过生物信息学方法与分子生物学方法分离鉴定三种蚊属的tra2基因，并通过RACE法获得了各种tra2基因的全长。蚊类tra2基因具有多种同系物且位于染色体不同部位，且能通过不同的可选择性启动子进行自我调控，生成不同mRNA。蚊类TRA2蛋白也包括基本的RRM与RS1，RS2结构域，且RRM结构域相对保守，其进化树分布与已知蚊类DSX蛋白进化树相似。不同物种之间TRA2蛋白的linker区域氨基酸序列最为保守，Linker结构域为TRA2蛋白特有。蚊类的tra2基因同系物中，发现一部分基因的RRM结构域局限于单一的exon之内，而目前已知物种的TRA2蛋白其RRM结构域均为跨exon分布。
　　 Asttra2-RB typeB基因在An.stephensi雌性体内特异表达的，主要表达部位位于雌性卵巢组织中。Asttra2-RBtypeC与Asttra2-RBtypeB，这两个基因在An.stephensi与Aedes.aegypti中在雄性中特异表达，主要表达部位位于生殖系统睾丸中。非特异性表达的tra2基因Asttra2-RA，Asttra2-RB typeA，Aeatra2-RA它们的表的方式是无期特异性的，从卵巢、卵早期阶段持续性表达至成虫阶段，且无性别特异性表达。但是表达量有所差异。
　　 使用siRNA，通过注射的方法对An.stephensi成蚊中的Asttra2-RA与Asttra2-RB基因表达成功的进行了抑制，通过显微注射对蚊卵中的靶基因Asttra2-RA表达成功的进行了抑制。结果证实在蚊类Asttra2-RA对下游dsx基因的选择性拼接起到调控作用，抑制Asttra2-RA的表达，将改变dsx雌性表达模式dssF，的表达。而Asttra2-RB基因表达抑制对dsx基因的选择性拼接没有影响，其在蚊虫中作用可能类似于果蝇中的反馈调节作用，也可能有其他未证实的功能。
　　 通过重复注射siRNa的方法，证实在蚊类Asttra2-RA对下游fruitless基因的选择性拼接起到调控作用，抑制Asttra2-RA的表达，将改变fruitless雌性表达模式fruF的表达，使之在雌性成蚊中出现雄性特异性fruM。同时由于Asttra2-RA对下游dsx基因的选择性拼接起到调控作用，抑制Asttra2-RA的表达，将改变dsx雌性表达模式asxF的表达，使之在雌性成蚊中出现雄性特异性dsxM.由于雄性的dsxM的出现对雌性特异性Vitellogenin基因表达产生抑制作用，从而进一步影响卵巢的发育。
　　 结论:蚊类tra2基因其具有多种同系物且位于染色体不同部位，可通过可选择性启动子进行自我调控，生成不同mRNA。tra2基因对蚊虫的性别分化起到关键的作用，调控下游性别决定基因dsx、fruitless的性别选择性拼接，以及雌性特异性基因vitellogenin的表达，最终影响雌性成蚊血餐后卵巢发育。

目录

第一部分

摘要

前言

第一章 重组蚊浓核病毒载体的构建

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

小结

第二章 重组病毒载体体外表达

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

小结

第三章 重组病毒蚊体内感染途径与分布

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第四章 实验室内重组病毒对白纹伊蚊幼虫的杀伤效果测试

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

第二部分

摘要

前言

第一章 蚊虫Transformer2基因的分离与鉴定

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

小结

第二章 tra基因的表达分析

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

小结

第三章 AsTtra2对dsx基因选择性拼接的调控研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

第四章 An.stephensi TRA2蛋白对Fruitless与vitellogenin基因的调控研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

缩略词汇表

博士期间成果

致谢

声明

统计学证明