放射线对Balb/c小鼠畸变产物耳声发射变化和耳蜗外毛细胞prestin表达影响的实验观察

摘要

目的：
　　 1、探讨单次放射线照射早期对Balb/c小鼠畸变产物耳声发射和耳蜗外毛细胞马达蛋白prestin表达的影响;
　　 2、探讨单次不同剂量的放射线照射早期对Balb/c小鼠畸变产物耳声发射和耳蜗外毛细胞马达蛋白prestin表达的影响:
　　 3、探讨放射线照射导致感音神经性耳聋的可能发病机制。
　　 材料与方法：
　　 1、实验动物
　　 选用正常出生后4周龄、排除外耳道及中耳感染的雄性Balb/c小鼠，体重17～22g（由南方医科大学实验动物中心提供），平均约20g。
　　 2、实验方法
　　 2.1放疗早期SNHL Balb/c小鼠模型的制备:
　　 小鼠称重，2％戊巴比妥钠溶液按0.3ml/100g的剂量行腹腔注射麻醉后，俯卧位固定，在X线下定位，确定内耳照射区域，然后于相同体位固定在直线加速器治疗床上，美国Varian2100直线加速器6MeV电子线、剂量率为400cGy/min、源皮距100cm，用铅档块避免呼吸道、消化道受照，参考深度为皮下1.5cm，分别给予各组受试小鼠右侧内耳单次不同剂量的放射线照射，在放射线照射后规定时间内对各项待测指标进行检测。
　　 2.2畸变产物耳声发射检测:
　　 在放射线照射前后规定时间内对各组受试小鼠分别进行DPOAE检测。用2％戊巴比妥钠溶液0.3ml/100g腹腔注射麻醉受试小鼠，水温40℃热水袋保温。将被检测小鼠置于隔声室中，用合适的探头塞入小鼠外耳道内并使之密封，当刺激信号平稳后进行检测。两个初始音f1和f2的频率比(f2/f1)为1.22，强度相同(L1=L2)，进行80dB SPL强度水平的检测;测试并记录0.5-12kHz频率范围内各个频率的DPOAE幅值、Noise值和各频率引出率情况，绘制成DPOAE听力曲线图及DPOAE输入输出函数曲线(DP-I/O)，比较放射线照射前后听觉生理功能的变化情况。
　　 2.3 Western Blotting分析prestin的表达情况:
　　 取两只小鼠迅速断头，分别快速摘下右侧耳蜗（2只）放入研钵中，加入液氮后研磨，研磨成粉末后分装在离心管中，加入200ul的RIPA裂解液，充分裂解后，12000g离心10分钟，取上清。加入6×蛋白上样缓冲液，煮沸5min，-20℃保存备用。各组取总蛋白200ug经10％ SDS-PAGE凝胶电泳分离后转移至硝酸纤维素膜。然后用20ml含5％脱脂奶粉的TBS缓冲液4℃封闭18小时，封闭后将杂交膜的β-actin和目的蛋白条带剪开，分别放入杂交袋中，加入用5％脱脂奶粉稀释的一抗，β-actin一抗稀释浓度为1∶500，目的蛋白一抗（羊抗鼠prestin多克隆抗体）稀释浓度为1∶200。4℃孵育18小时。一抗孵育后的杂交膜用1×TBST漂洗3次，每次10min，然后分别放入杂交袋中，加入用5％脱脂奶粉稀释的过氧化物酶标记二抗，β-actin对应的二抗稀释浓度为1∶2000，目的蛋白对应的二抗(兔抗羊IgG)稀释浓度为1∶3000。室温孵育1.5小时。然后用1×TBST洗膜3次，每次10分钟。最后在暗室内加入ECL化学发光底物，曝光，依次放入显影液和定影液。选用β-actin作为内参照，并用凝胶成像系统软件SC805进行分析结果。各组中prestin与β-actin吸光度的比值与正常组比较，来判断其表达变化。
　　 2.4荧光实时定量PCR检测prestin mRNA的表达:
　　 从GenBank数据库中查找出小鼠prestin基因序列。使用Primer5.0软件设计小鼠prestin引物、探针，内参β-actin引物及探针序列。首先将各组取得的耳蜗组织在液氮中磨成粉末（全程保持液氮湿润），取50～100mg的样品粉末置于无RNAase的1.5ml离心管中，按Biozol公司提供的Biozol RNA提取试剂盒的使用说明提取RNA。然后用TaKaRa公司提供的Recombinant DNaseⅠ(RNase-free)对进行RNA进行纯化，纯化后取3～4μl RNA样品进行快速的非变性琼脂糖凝胶（1.0％胶浓度）180v10min电泳来检测RNA的完整性并用紫外分光光度计检测RNA的浓度及纯度。然后按照Toyobo公司提供的ReverTraAce-a-反转录试剂盒的使用说明书将变性总RNA反转成第一链cDNA，反应结束后保存于-20℃待用。将目的基因和内参基因的cDNA样本分别取样在荧光定量PCR仪(ABI7500)上进行反应，每个样本设置3个平行实验。PCR反应体系为20ul，反应条件为95℃2min;95℃15S，60℃40S，45个循环，60℃获取荧光信号;循环结束后从65℃升高到95℃获取溶解曲线。
　　 2.4统计方法
　　 统计软件采用SPSS13.0，进行One-way ANOVA分析，取α=0.05，方差齐者用LSD法行组间两两比较，方差不齐者用Dunnett's T3法行组间两两比较。
　　 结果：
　　 1、成功建立了放疗早期SNHL Balb/c小鼠模型;
　　 2、给予总放射剂量为16Gy的放射线照射小鼠时:放射线照射前组、照射后第3天组及照射后第7天组小鼠在0.5、1和2kHz时DPOAE引出率均较低，在3、4、6、8、10和12kHz时DPOAE引出率均为100％;在3、4、6、8、10和12kHz时照射后第3天组和照射后第7天组小鼠的DPOAE幅值较照射前组小鼠均降低，有统计学意义(P＜0.05)，照射后第7天组小鼠的DPOAE幅值在大部分频率上要比照射后第3天组小鼠的DPOAE幅值要低，有统计学意义(P＜0.05);从10和12kHz时的I/O曲线上可以看到照射后第3天组和照射后第7天组小鼠较照射前组小鼠的曲线明显降低，即在10和12kHz时各种相对应的刺激强度下照射后第3天组和照射后第7天组小鼠较照射前组小鼠的DPOAE幅值明显降低;照射后第3天组和照射后第7天组小鼠的耳蜗prestin及其基因prestin mRNA的表达较照射前组小鼠出现一致性下降，且照射后第7天组小鼠的耳蜗prestin及其基因prestin mRNA的表达较照射后第3天组小鼠下调，有统计学意义(P＜0.05)。
　　 3、分别给予0、8、12、16Gy剂量的放射线照射时:各照射组小鼠在第7天检测3、4、6、8、10和12kHz时的DPOAE幅值均较正常对照组小鼠明显降低，有统计学意义(P＜0.05);随着放疗剂量的增加，DPOAE幅值呈现逐渐下降的趋势，在部分频率的差异有统计学意义(P＜0.05)。各放疗组小鼠在放射线照射后第7天检测耳蜗prestin及其基因prestin mRNA的表达较正常对照组小鼠均下降，有统计学意义(P＜0.05);随着放射线剂量的增加，小鼠耳蜗prestin及其基因prestin mRNA的表达逐渐下降，有统计学意义(P＜0.05)。
　　 结论：
　　 1、单次大剂量的放射线照射早期即可损伤小鼠的内耳结构和功能，导致小鼠耳蜗外毛细胞膜上的马达蛋白prestin及其基因prestin mRNA的表达下调，同时损害了小鼠的听觉生理功能;
　　 2、不同剂量的放射线照射对小鼠的内耳结构及听觉生理功能损害的程度不同，随着放射线剂量的不断加大，损害程度也不断加重;
　　 3、放射线照射导致SNHL可能与放射线引起耳蜗外毛细胞prestin功能表达的改变有关。

目录

摘要

前言

第一章 单次放射线照射早期Balb／c小鼠畸变产物耳声发射变化和耳蜗外毛细胞Prestin表达的实验观察

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二章 不同剂量放射线对小鼠畸变产物耳声发射和外毛细胞prestin表达的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

课题结论

英文缩写注解

综述(一) 哺乳动物耳蜗外毛细胞马达蛋白：prestin的研究进展

综述(二) 影响prestin表达和调控因素的相关研究

攻读学位期间成果

致谢

声明