香蕉枯萎病菌1号生理小种T-DNA插入突变体库的建立及部分致病相关突变体插入位点定位

摘要

香蕉枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)又名香蕉巴拿马病、黄叶病,是由古巴尖镰孢侵染引起的毁灭性土传维管束病害。Foc有4个生理小种,对我国香蕉造成严重危害的是1号和4号2个生理小种,由于Foc的遗传背景复杂,对其致病机理了解甚少,目前尚无十分有效的防治方法,也未培育出高抗枯萎病的品种,因此,只有深入了解香蕉枯萎病菌的致病性遗传及其变异机制,才能为抗病品种培育及防治策略的制定提供理论依据。
　　 本研究利用T-DNA插入技术,建立了香蕉枯萎病菌1号生理小种遗传转化体系,构建了包含1200个突变体的突变体库,并对这1200个突变体进行了致病性测定,对部分致病性丧失突变体、致病性严重减弱突变体、致病性增强突变体进行了T-DNA插入位点右翼序列克隆分析,具体结果如下:
　　 1.建立了Focr1-N2菌株(基因组测序用菌株)的T-DNA插入遗传转化体系,并对影响转化效率的因子进行了优化,明确了高效转化的条件为:农杆菌OD600为0.15,AS诱导浓度为150μmol/L,诱导时间为7小时,Focr-N2孢子浓度为1×106个/ml,潮霉素B筛选的浓度为150μg/mL,诱导培养基pH值为5.5,共培养温度为25℃,共培养时间为48小时为最佳条件。
　　 2.建立了包含1200个突变体的突变体库,对1200个突变体进行了致病性测定初步筛选出致病性丧失突变体20个,致病性显著减弱突变体18个,致病性严重增强突变体53个,对粉蕉和巴西蕉致病性均严重增强的突变体2个,对粉蕉致病性严重减弱但对巴西蕉致病力严重增强的突变体1个。
　　 3.4个致病性丧失突变体Focr1-N2-65、Focr1-N2-194、Foer1-N2-273和Focr1-N2-328,2个致病性减弱突变体Focr1-N2-71和Focr1-N2-73,3个致病性严重加强突变体Focr1-N2-409、Focr1-N2-418和Focr1-N2-531,采用TAIL-PCR方法对其T-DNA插入位点右翼序列进行了PCR扩增,从这9个突变体中克隆获得15条TAIL-PCR产物,通过测序分析,除Focr1-N2-409外,其余8个突变体的T-DNA位点右翼序列都可在在Focr1-N2基因组序列中找到。
　　 本研究成功获得了一批致病性丧失、严重减弱、严重增强突变体,获得了部分突变体的T-DNA插入位点右翼序列,并在1号小种全基因组中找到了其序列,为下一步克隆致病相关基因奠定了良好基础

目录

文摘

英文文摘

1 前言

1.1 香蕉枯萎病的致病性研究

1.1.1 香蕉枯萎病菌的香蕉枯萎病菌的生物学特性

1.1.2 香蕉枯萎病菌的生理小种

1.1.3 香蕉枯萎病发病规律

1.1.4 香蕉枯萎病菌的分子生物学研究

1.1.5 香蕉枯萎病的危害症状

1.2 香蕉枯萎病的抗病性研究

1.2.1 香蕉枯萎病的抗病机制

1.2.2 香蕉枯萎病的综合防治

1.3 根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化的研究进展

1.3.1 根癌农杆菌介导遗传转化的丝状真菌的种类

1.3.2 根癌农杆菌介导真菌遗传转化的机理

1.3.3 根癌农杆菌介导丝状真菌转化的特点

1.4 本研究的目的意义和技术路线

1.5 引言

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 菌株和质粒

2.1.2 供试香蕉叶片和香蕉苗

2.1.3 培养基和培养条件

2.1.4 主要实验试剂

2.1.5 主要仪器设备

2.2 方法

2.2.1 菌株的复壮

2.2.2 野生型1号小种对潮霉素B的敏感性检测

2.2.3 ATMT转化体系中根癌农杆菌的处理

2.2.4 香蕉枯萎病1号小种Focr1-N2分生孢子的准备

2.2.5 1号小种病原菌Focr1-N2的转化及筛选

2.2.6 共培养条件的优化

2.2.7 香蕉枯萎病菌Focr1-N2转化的突变体的分析

2.2.8 转化子的PCR验证

3 结果与分析

3.1 FOCR1菌株N2对潮霉素敏感实验

3.2 共培养条件的优化

3.2.1 Focr1孢子浓度对转化效率的影响

3.2.2 AS浓度对转化效率的影响

3.2.3 农杆菌菌株AGL-1浓度对转化效率的影响

3.2.4 共培养时间对转化效率的影响

3.2.5 共培养温度对转化效率的影响

3.2.6 pH值对转化效率的影响

3.3 转化子的遗传稳定性检测

3.4 转化子生长对比检测结果

3.5 突变体的表型分析

3.6 温度、pH值及碳源对病原菌FOCR1-N2菌丝体生长的影响

3.7 转化子致病力的测定

3.7.1 转化子接种粉蕉的致病力测定

3.7.2 转化子接种巴西蕉的致病力测定

3.8 香蕉枯萎病菌FOCR1 N2基因组DNA的提取质量检测

3.9 T-DNA插入的PCR检测

3.10 T-DNA插入位点的侧翼序列扩增和分析

3.10.1 香蕉枯萎病菌Focr1-N2菌株突变株的TAIL-PCR结果

3.10.2 TAIL-PCR产物的克隆

3.10.3 T-DNA插入位点的侧翼序列的分析

4 讨论

4.1 关于香蕉枯萎病菌的遗传转化效率和突变体库构建问题

4.2 T-DNA的插入存在的问题

4.3 TAIL-PCR运用的优缺点

4.4 突变体的表型分析及突变体致病性稳定分析

4.5 关于T-DNA插入位点的侧翼序列获得及分析

5 问题与展望

6 结论

参考文献

致谢