临床痰标本中L型细菌的筛查及结核分枝杆菌利福平依赖变异研究

摘要

第一部分：临床痰标本中筛查结核分枝杆菌L型菌株
　　 目的：从就诊于甘肃省兰州市肺科医院的痰标本中筛查结核分枝杆菌L型菌的存在情况；初步研究临床标本中L型结核分枝杆菌形态学变异。
　　 方法：为了筛查L型结核分枝杆菌，我们将2008年9月至2009年9月于兰州市肺科医院就诊的340例痰培养标本分别接种于罗氏培养基、MiddlebrookMGIT-960液体培养基、92-3TB含和不含氯化钠液体培养基以及Middlebrook7H9含和不含蔗糖的半固体培养基中，观察其菌落生长状况。
　　 采用萋尔-纳尔逊(Ziehl-Neelsen)抗酸染色法将L型细菌培养基生长的菌落进行涂片、染色、油镜下观察细菌的形态。抽提菌株DNA，PCR扩增16S rRNA基因序列，进行菌株的初步鉴定。由于牛分枝杆菌缺失RD7区(RV1970F)，结核分枝杆菌不存在RD7缺失，通过扩增RD7区(RV1970F)片段进行牛分枝杆菌和结核分枝杆菌的区分。
　　 结果：痰标本编号为1415标本，在含蔗糖的7H9(7H9-L)半固体培养基上可见煎蛋样嵌入性生长，涂片抗酸染色可见抗酸染色阴性杆状菌。PCR扩增16SrRNA基因序列分析该菌属于结核分枝杆菌复合群。PCR扩增该菌RD7片段显示，该菌为结核分枝杆菌。感染该菌的患者为男性，19岁，有一年半的结核病史。
　　 结论：用7H9高渗半固体培养基可以从临床痰标本中分离出结核分枝杆菌L型菌株。该患者的肺部感染可能与L型的结核分枝杆菌有关。
　　 第二部分：支气管戈登菌L型菌株所致肺部感染
　　 目的：从就诊于兰州市肺科医院的痰标本中筛查L型细菌，并进行L型细菌鉴定、表型变异及致病性研究。
　　 方法：我们将2008年9月至2009年9月于兰州市肺科医院就诊的340例痰培养标本分别接种于罗氏培养基、Middlebrook MGIT-960液体培养基、92-3TB含和不含氯化钠液体培养基以及Middlebrook7H9含和不含蔗糖的半固体培养基中，观察其菌落生长状况。将培养L型细菌培养基培养阳性的菌落做革兰氏(Gram)染色和ZN抗酸染色法；并传代培养，观察菌株的形态，是否存在返祖现象；同时做扫描电镜观察细菌的形态。提取分枝杆菌DNA，PCR扩增16S rRNA基因序列进行菌种鉴定。
　　 结果：痰标本编号为866和1302，在含蔗糖的7H9(7H9-L)半固体培养基上呈煎蛋样嵌入性生长，在含氯化钠的92-3TB液体培养基也生长。866和1302菌株涂片抗酸染色镜下观察可见大小不等的抗酸阴性球形菌。传代培养两代后可见橘红色菌落，涂片抗酸染色可见少量抗酸染色阳性杆状菌，电镜观察见菌体为杆状。PCR扩增16SrRNA DNA，经序列比对分析发现该菌株为放线菌目戈登氏菌属的支气管戈登菌(Gordonia bronchialis,G.bronchialis)。该支气管戈登菌属对利福平和利福喷丁敏感，而对异烟肼、吡嗪酰胺、对氨基水杨酸、乙胺丁醇、乙硫异烟胺以及链霉素均耐药。痰标本编号866的患者，男性，78岁，间断性咳嗽咯血四年。痰标本编号为1302患者为门诊病人，男性，38岁。
　　 结论：L型支气管戈登菌在临床痰标本中存在，可能与肺部感染有关。
　　 第三部分：临床痰标本中结核分枝杆菌利福平依赖表型变异研究
　　 研究目的：从就诊于甘肃省兰州市肺科医院的痰标本中筛查利福平依赖结核分枝杆菌，初步研究利福平依赖结核分枝杆菌表型变异和rpoB突变研究。
　　 方法：甘肃省兰州市肺科医院检验科培养的200例痰标本，经过消化液消化，离心集菌，接种于Middlebrook MGIT960液体培养基、含与不含利福平的罗氏培养基静置培养，观察菌落生长情况.如果菌株为利福平依赖株，接种于含与不含利福平的罗氏培养基进行传代培养。Middlebrook MGIT960液体培养基培养阳性菌株运用绝对浓度法做药敏试验。采用萋尔-纳尔逊(Ziehl-Neelsen)抗酸染色法对罗氏培养基有菌落生长的标本进行涂片、染色、油镜下观察细菌的形态。提取分枝杆菌DNA，PCR扩增长度为580 bp的16S rRNA DNA序列和rpoB基因高变区3519 bp，分别进行基因学菌种鉴定以及rpoB基因序列的突变研究。
　　 结果：200例痰标本中筛查到6例利福平依赖的菌株。6株利福平依赖菌株中男性3人(50％)，女性3人(50％)，平均年龄37.8岁(范围25-55岁)。这六株利福平依赖菌株药敏结果显示耐利福平6例、耐SM的4例、耐INH的1例、耐PZA的4例以及耐TH的1例。抗酸染色显示在不含有利福平的培养基中的菌落细小，在含有利福平的培养中菌体粗大。传代培养后，在罗氏培养基中观察利福平依赖菌株对利福平的依赖现象不明显。但是抗酸染色结果显示仍然是细菌在不含有利福平的培养基中的菌落细小，在含有利福平的培养中菌体粗大。经16SrRNA基因鉴定这六株利福平依赖菌株均属于结核分枝杆菌复合群。其中两株rpoB序列有基因突变。
　　 结论：临床标本中存在利福平依赖变异。利福平依赖菌株是利福平耐药的一种特殊形式。

目录

论文说明：缩略词表

声明

第一部分：临床痰标本中筛查结核分枝杆菌L型菌株

文摘

英文文摘

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分：支气管戈登菌L型菌株所致肺部感染

文摘

英文文摘

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分：临床痰标本中结核分枝杆菌利福平依赖表型变异研究

文摘

英文文摘

前言

材料及方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述：结核分枝杆菌L型细菌的研究进展

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