用于诊断依赖利福平结核分枝杆菌结核病的结核分枝杆菌蛋白

摘要

本发明涉及一种具有依赖利福平生长的特异性结核分枝杆菌(其保藏号为：CGMCC NO.1570)。还涉及依赖利福平结核分枝杆菌蛋白，其具有如序列1所示的氨基酸序列，其分子量为43894道尔顿，pI值为5.25。还涉及一种核酸，其具有如序列2所示的核苷酸序列。本发明还涉及采用人工诱导依赖利福平结核分枝杆菌，获得高表达浓度的所述依赖利福平结核分枝杆菌蛋白的方法。涉及包含所述依赖利福平结核分枝杆菌蛋白的组合物、试剂盒以及所述试剂盒在临床诊断依赖利福平结核分枝杆菌结核病、耐多药结核病及其流行病学监测调查中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种结核分枝杆菌蛋白，以及该蛋白在依赖利福平结核分枝杆菌的临床诊断和流行病学监测等方面的应用，及其该蛋白作为药物靶标在耐多药结核病治疗新药开发的应用。

    背景技术

2000年全国第四次结核病流行病学抽样调查结果显示：我国约有500万结核病患者，五亿结核病感染者，结核病疫情仍然很严重。WHO估计，当今世界约有2/3的结核病患者处于发生耐药病例的危险之中。由于耐药菌，特别是耐多药菌的不断产生和传播，是当今结核病难以控制的关键。

依赖利福平结核分枝杆菌(以下简称依R菌)。依R菌是本发明第一发明人首次在临床肺结核患者痰标本中，通过分枝杆菌罗氏培养的药敏试验结果菌落观察发现和研究报道的，具有依赖利福平(R)抗结核药物生长的特殊结核分枝杆菌。依R菌生物学特性主要表现为，在适宜的利福平浓度下其细菌生长旺盛，离开利福平生长不良或不能生长。如图1所示，同时发现在有R和无R条件下两种条件下生长细菌的蛋白质表达不同，前者有标志性高表达蛋白，如图4(c)所示。

大量研究表明依R菌在有R和无R条件下生长的细菌其形态、结构、染色性、毒力和蛋白质表达等方面均有明显差异。而且，依R菌中有74.4％～100％为耐多药结核菌。依R菌肺结核具有病情重、耐多药、化疗效果差和预后不良的临床特征，比一般的耐药病例危害更大。依R菌产生与传播给结核病的控制又提出新的难题。目前各地报道的依R菌在分枝杆菌培养阳性后的药物敏感试验中的发生率为6％～17％，这对于我国是一个结核病高发病率的国家，数值是惊人的。

目前，利福平是结核病初治化疗组合方案中的主要杀菌药，是初治结核病治疗的必选药物，其使用非常广泛。依R菌感染所导致的结核病如果再使用利福平，不但化疗将失败，而且可使病情恶化，是难治性结核病的产生和化疗失败的重要原因之一。因此，临床对依R菌结核病的早期诊断和有效治疗的需求都十分迫切。现有常规方法从分枝杆菌的分离培养到药物敏感实验，至少需要2个月左右的时间才能观察到致病菌是否存在药物依赖现象，而且现有方法只能针对痰菌培养阳性的肺结核病人，对半数以上的痰菌阴性肺结核和肺外结核病患者来讲，常规细菌学方法是根本无能为力的。因此，寻求一种快速简便和有效的方法用于依R菌结核病的诊断非常急迫。

本发明通过大量研究发现，依R菌在试管内适宜浓度利福平的诱导下可高表达量(占总细菌蛋白的30-50％)产生一种特定氨基酸序列的细菌蛋白。并通过大量临床试验证实，该特定氨基酸序列的细菌蛋白具有免疫活性功能，用于依R菌结核病的血清学快速诊断具有高度的特异性和良好的敏感性。

本发明的依R菌特定氨基酸序列的结核分枝杆菌蛋白，不仅是1种依R菌结核病的诊断蛋白，还可作为开发新的有效的耐多药结核病治疗的药物靶标。因为，大量研究发现依R菌中有74.4％～100％都为耐多药结核菌。

发明内容

发明简述

本发明的目的是提供一种具有依赖利福平(以下简称依R)生长的特异性的结核分枝杆菌、编码结核分枝杆菌蛋白如序列2所示的核苷酸序列，以及诱导依R菌核苷酸序列表达的依R结核分枝杆菌蛋白的方法。本发明还包括所述依赖利福平结核分枝杆菌蛋白的试剂盒及其在临床诊断依赖利福平结核分枝杆菌结核病、耐多药结核病及其流行病学监测调查中的应用。

本发明涉及的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，其具有依赖利福平生长的特异性，其保藏号为：CGMCC NO.1570，保藏时间：2005年12月19日，参据的菌株号为：1219。

本发明涉及的依赖利福平结核分枝杆菌蛋白，其具有如序列1所示的氨基酸序列，其分子量为43894道尔顿，pI值为5.25。

本发明涉及一种核酸，其具有如序列2所示的核苷酸序列。

本发明所指的依R菌结核分枝杆菌蛋白由序列2所示的核苷酸序列的核酸表达，所表达的蛋白的氨基酸序列如序列1所示。

本发明的结核分枝杆菌蛋白通过典型依R结核分枝杆菌诱导的方法如下：

1)分离鉴定筛选临床典型依赖利福平结核分枝杆菌菌株(保藏号为：CGMCC NO.1570，参据的菌株号为：1219)

2)在7H9液体培养基中，以利福平6～24μg/ml作为诱导浓度培养获得富含序列2蛋白的依R菌株；

3)或在L-J固体培养基中以利福平50～300μg/ml作为诱导浓度培养获得富含序列2蛋白的依赖利福平结核分枝杆菌株；

4)制备步骤2或3诱导后的依赖利福平结核分枝杆菌蛋白溶液；

5)分离蛋白、回收、纯化和复性即获得依赖利福平结核分枝杆菌蛋白。

本发明的结核分枝杆菌蛋白也可以利用序列2所示的核苷酸序列，通过常规基因工程方法表达氨基酸序列如序列1所示的蛋白。

本发明涉及包含发明结核分枝杆菌蛋白的试剂盒。

本发明涉及一种新的结核病快速诊断方法，包含依R结核分枝杆菌株的发明结核分枝杆菌蛋白直接诊断，以及用血清学试验来辅助诊断依R菌结核病和进行流行病学调查等。

本发明的依R结核分枝杆菌特定氨基酸序列的结核分枝杆菌蛋白，不仅是一种依R结核分枝杆菌结核病的诊断蛋白，还可作为开发新的有效的耐多药结核病治疗的药物靶标。因为，大量研究发现依R结核分枝杆菌中有74.4％～100％都为耐多药结核菌。

发明详述

本发明公开了一种编码结核分枝杆菌蛋白的如序列2所示的核苷酸序列，其编码的结核分枝杆菌蛋白制备的方法，由该方法制备的包含序列1所示氨基酸序列的结核分枝杆菌蛋白，以及包含该发明蛋白的试剂盒。同时还公开了他们在依R菌结核病诊断和流行病学调查监测中的应用。另外，本发明的结核分枝杆菌蛋白不仅是一种依R菌的诊断蛋白，还可作为开发新的有效的耐多药结核病治疗的药物靶标。因为，大量研究发现依R菌中有74.4％～100％都为耐多药结核菌。

本发明的结核分枝杆菌蛋白采用典型依R菌体外人工诱导编码基因表达的方法，可以获得高表达量的发明蛋白，如实施例2所叙述。该发明蛋白也通过基因工程的常规方法表达、回收和纯化，还可以使用蛋白合成仪器系统直接合成。优选采用人工诱导方法，因为该法简单有效，成本低，重要的是获得的蛋白具有良好的功能活性。同时，可以避免基因工程常规方法表达蛋白，在表达、回收和纯化等过程可能引起的抗原丢失和产物功能活性的降低及不忠实性增强的可能。

本发明的一个实施方案涉及用上述方法制备的结核分枝杆菌蛋白组合的试剂盒。

本发明所公开的依R菌结核病血清免疫学诊断试剂盒，是指包括本发明的结核分枝杆菌蛋白组配的成套检测试剂。该试剂盒用于依R菌结核病的快速辅助诊断，或用于依R菌结核病的流行病学调查和监测。该试剂盒的检测方式为单人份检测板系统，其试剂盒包含20～50个已装配好的密封检测板。本发明的结核分枝杆菌蛋白已预先固定在检测板中的膜上(可4～8℃干燥保存6月以上)。该试剂盒的其它组合检测试剂还包括：封闭液、胶体金标记的羊抗人IgG抗体和PBS洗涤液，以及阳性和阴性质量控制血清等。该试剂盒在分离获得临床检测样品后，单样品抗体检测的时间只需数分钟即可完成。开展此项目的临床检测不需要特殊的仪器设备。其方法简单、快速、成本低，适于基层医疗单位推广应用。

本试剂盒所能检测的生物样品可包括血清、脑脊液、尿掖和穿刺液等可能含有血清抗依R菌蛋白抗体的临床样本，优先选用血清样本。

上述依R菌结核病血清免疫学诊断试剂盒中所用到的包含本发明结核分枝杆菌蛋白的所有试剂或试剂盒都包括在本发明的范围内。

本发明的结核分枝杆菌蛋白，也可直接经过标记，如酶、荧光物质、发光物质和放射性物质等，通过相应的检测仪器直接检测更微量的特异性抗体。优选的标记物是发光物质，如异鲁米诺、光泽精和鲁米诺等，其敏感性、稳定性和完全性更佳。

本发明的结核分枝杆菌蛋白，还可以通过基因工程和动物模型制备单克隆抗体，研制依R菌蛋白抗原的检测系统和试剂盒，用于依R菌及其蛋白抗原的直接检测，其检测方法可采用各种标记的组织化学、免疫血清和流式细胞仪等，其检测样本可包括痰、组织和血清等各种临床样本和培养物。

附图说明

附图1为依R菌株单个菌落的生长对比图；图中的依R菌株由重庆市肺科医院——重庆市结核基因诊断中心实验室临床分离，L-J培养基，采用浓度梯度法试验获得；图中R100管内为依R菌株在含R浓度为100μg/ml培养管中的生长情况，其菌落呈典型“菜花样”生长，生长旺盛，易刮取。而对照管中反映的是依R菌株在无R条件下的生长情况，其菌落呈典型“荷包蛋样”，且呈嵌入生长，不易刮取，表现为严重的生长不良状态。

附图2为依R菌在R浓度为8μg/ml时培养瓶中的生长曲线；图中反映依R菌株在有R情况下生长旺盛，生长曲线呈典型的抛物线型；

附图3为依R菌在无药对照培养瓶中的生长曲线；图中反映R菌株在无R情况下生长生长缓慢、代谢状况低下，生长曲线平缓。

图2和图3显示临床肺结核患者痰标本中分离鉴定的依R菌，在7H9液体培养3D系统中不同条件下细菌的生长曲线。图2显示BacT/ALERT 3DSelect系统含R：8μg/ml培养瓶中的生长曲线呈抛物线，其延滞期8.09天，初始反射率：1750，最大反射率：3429，最大反射率绝对值：1679；图3显示无药对照瓶的生长曲线呈平缓斜线，其延滞期17.09天，初始反射率：1750，最大反射率：2461最大反射率绝对值：711。图2和图3显示依R菌在有R和无R条件下的生长曲线差异明显。

[图2和图3生长曲线注释]

横轴：培养时间(天)

纵轴：反射率(细菌生长产生CO2，密闭培养瓶底乳胶感应器产生不可逆颜色改变导致系统监测的反射率增加)

生长曲线：系统每10分钟读数一次监测反射率，所建立的生长反应曲线(初始反射率：1750)

接种菌液浓度：10-4μg/ml

总培养时间：40天(39.78)

附图4为诱导依R菌株的SDS-PAGE蛋白图谱；图中1.2.3(b)是以L-J培养基，在R浓度为100μg/ml时诱导的依R菌株高表达的本发明蛋白；相对于标准分子量43.000处，显示出明显的考马斯亮兰(电压100V、电泳时间3.5小时)；M的右侧(a)为电转移于PVDV膜上的本发明蛋白；(c)是诱导与未诱导的依R菌蛋白的比较(电压100V、电泳时间2.5小时)可明显观察出在R浓度为100μg/ml时诱导的依R菌株高表达的本发明蛋白。

附图5为本发明蛋白带总离子流质谱图(1)，图中质谱图采用Q-TOF2型LC-ESI-MS-MS系统分析，其中：横坐标：质荷比(m/z)、纵坐标：离子质量百分比(100％)、波峰：为目标蛋白的N个肽段。

附图6为本发明蛋白带总离子流质谱图(2)，图中质谱图采用Q-TOF2型LC-ESI-MS-MS系统分析，其中：横坐标：质荷比(m/z)、纵坐标：离子质量百分比(100％)；波峰：为本发明蛋白的N个肽段。

附图7为在图5或图6总离子流质谱图中的m/z 656.83肽段串联质谱氨基酸序列解析图(1)，图中质谱图采用Q-TOF2型LC-ESI-MS-MS系统分析，其中：横坐标：质荷比(m/z)、纵坐标：离子质量百分比(100％)、纵坐标上方：为肽段氨基酸序列解析结果。

附图8为在图5或图6总离子流质谱图中的m/z 656.83肽段串联质谱氨基酸序列解析图(2)，图中质谱图采用Q-TOF2型LC-ESI-MS-MS系统分析，其中：横坐标：质荷比(m/z)、纵坐标：离子质量百分比(100％)、纵坐标上方：为肽段氨基酸序列解析结果。

附图9为在图5或图6总离子流质谱图中的m/z 656.83肽段串联质谱氨基酸序列解析图(3)，图中质谱图采用Q-TOF2型LC-ESI-MS-MS系统分析，其中：横坐标：质荷比(m/z)、纵坐标：离子质量百分比(100％)、纵坐标上方：为肽段氨基酸序列解析结果。

附图10为在图5或图6总离子流质谱图中的m/z 656.83肽段串联质谱氨基酸序列解析图(4)，图中质谱图采用Q-TOF2毛细管液相色谱-电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱仪(LC-ESI-MS/MS，Q-TOF2)系统分析，其中：横坐横坐标：质荷比(m/z)、纵坐标：离子质量百分比(100％)、纵坐标上方：为肽段氨基酸序列解析结果。

附图11为在图5或图6总离子流质谱图中的m/z 656.83肽段串联质谱氨基酸序列解析图(5)，图中质谱图采用Q-TOF2型LC-ESI-MS-MS系统分析，其中：横坐标：质荷比(m/z)、纵坐标：离子质量百分比(100％)、纵坐标上方：为肽段氨基酸序列解析结果。

附图12为本发明蛋白肽段氨基酸序列检索结果表。

图13为Rv0341的编码基因PCR扩增电泳图；图中显示不同菌株的Rv0341编码基因DNA扩增片段电泳结果。图中：M：分子量标准、1：H37Rv标准菌株、2：耐R菌株、3：依R菌株、4：试剂空白对照。

图14显示免疫印迹胶体金标记法血清抗体检测结果，图的左边为典型依R菌肺结核患者血清抗依R菌Rv03411蛋白抗体阳性结果，图右边为正常人血清阴性结果。

具体实施方式

实施例1：依R菌的分离鉴定

本发明的结核分枝杆菌蛋白采用典型依R菌体外人工诱导编码基因表达的方法。依R菌的分离鉴定筛选采用的罗氏(L-J)分枝杆菌培养、菌种鉴定及绝对浓度间接法药敏实验均按《结核病诊断细菌学检验规程》要求进行[中国防痨协会.中国防痨杂志，1996，18：28-31.1。也可以采用7H9液体3D培养系统，通过生长曲线等指标进行判断。

依R菌筛选的判断标准是具有在常规L-J绝对浓度间接法药敏培养中，其细菌在R培养管(R250μg/ml或R50μg/ml)中菌落生长粗大旺盛，对照管中菌落细小、生长不良(呈L型生长)的菌种鉴定为结核分枝杆菌的一类细菌被判定为依R菌，如图1所示。耐R菌则在含R管和对照管中细菌生长的旺盛程度(菌落外观形态)相同。7H9液体3D培养系统生长曲线的对比差异，也可作为判断依据，如图2和图3所示。

研究将临床筛选的典型依R菌株(保藏号：CJMCC No：1570，参据的菌株号为：1219)，通过不同利福平浓度的梯度实验筛选的其最佳药物浓度，作为诱导该发明结核分枝杆菌蛋白的药物浓度。其罗氏培养的最佳利福平药物浓度为100μg/ml，7H9液体培养的最佳利福平药物浓度为8μg/ml。

本发明的结核分枝杆菌蛋白采用3-4周培养的典型临床依R菌株(菌种编号：1219，CJMCC No：1570)菌悬液(10^-2mg/ml)，接种于含利福平终浓度为8μg/ml的7H9液体培养基或含100μg/ml的罗氏培养基35～37℃培养3-4周。获得的高表达发明蛋白依R菌株，以常规分枝杆菌菌种保存方法-70℃冻存。

实施例2：本发明的结核分枝杆菌蛋白的制备

本发明的结核分枝杆菌蛋白的制备，采用实施例1准备的高表达发明蛋白依R菌株的培养菌液(或取菌落于PBS缓冲液)经巴氏灭活后，离心去上清，并再用PBS缓冲液洗涤2次后，每2mg细菌沉淀物加1×加样缓冲液(SDS加倍量)100μl和直径200μm的玻璃珠2mg，然后于水浴超声仪中超声15min，沸水中10min，20℃14000转/min离心8min，收集上清液备用。然后将其上清液样品用紫外分光光度计定量蛋白浓度，电泳样品的控制在1～2g/L之间。SDS-PAGE电泳条件为：5％积层胶，10％分离胶，样品15～20μl，电压100V，电泳3～4h，电泳胶考玛斯亮蓝染色定位目标蛋白。如图4右所示。

本发明的结核分枝杆菌蛋白的回收，采用直接定位切割以上SDS-PAGE胶中的目标蛋白，用常规方法进行回收、纯化和复性。同时，也可采用常规电转移技术直接转印SDS-PAGE胶中的蛋白到PVDV膜上后，定位切割1条膜考玛斯亮蓝染色定位目标蛋白，如图4左所示。然后定位切割膜上目标蛋白带，用于分析或检测。后者蛋白的丢失及其功能活性的影响较小，成本较低，可优选采用。

实施例3：本发明的结核分枝杆菌蛋白的氨基酸序列鉴定

本发明蛋白氨基酸序列的鉴定采用Q-TOF2型LC-ESI-MS-MS仪器系统。由军事医学科学院国家生物医学分析中心质谱室提供服务。其基本方法是切割实施例2获得的发明蛋白带，经回收纯化后，先进行一次肽混合物质谱分析，如图5-6所示；再对其中5个肽段进行串联质谱(标签序列)，解析出各肽段的氨基酸序列，如图7-11所示；然后检索比对，检索结果如图12所示。即本发明的结核分枝杆菌蛋白经氨基酸序列鉴定为结核分枝杆菌H₃₇Rv假设蛋白Rv0341，相对分子质量：43894，等电点(PI)5.25，得分183，氨基酸序列如序列2所示。

实施例3：本发明的结核分枝杆菌蛋白编码基因序列分析

本发明的结核分枝杆菌蛋白编码基因的扩增，是根据Genbank提供的序列资料，借助计算机辅助设计实施例2结果的结核分枝杆菌H₃₇Rv假设蛋白Rv0341编码基因(409360-410799序列)1440bp片段的扩增引物I(5’-CGATTACATCCTGAGCCTGTT-3’)和引物II(3’-GGTAGTCCGAAAAGGCCGTA-5’)。细菌DNA提取：采用美国Promega公司DNA提取试剂盒(批号：178886)，按其说明书方法提取实验菌株DNA。PCR扩增体系按常规条件配制[10]，扩增条件为：95℃5min后，以95℃1min、52℃1min和72℃2min循环35次，72℃延伸10min，4℃保存。

Rv0341蛋白编码基因扩增片段的DNA序列分析，是将编码基因进行分段DNA序列测序、交叉部分和两端另设计引物重复测序，以重复一致的结果为准。测序使用的相关引物，除编码基因扩增引物外，还有目标片段上游末端延伸测序引物(5’-GTATTGGGACGGGTCTGG-3’和3’-ATGAACCCGCCAGTGAC-5’)、中段290bp反向延伸引物(3’-GCTAGCCAGATCGGTGTC-5’)，以及目标片段下游末端延伸测序引物(5’-ACATTGGCGACGTCCTG-3’和3’-ATGAACCCGCCAGTGAC-5’)。PCR扩增产物的纯化、DNA序列测定(相关引物设计合成)及结果的比对等均由上海基康生物技术有限公司提供服务。

用以上方法对从实施例1随机抽取的依R菌株、耐R菌株和R敏感株各10株进行Rv0341编码基因的PCR扩增，结果均获得1440bp片段(图13)。其片段经分段测序、交叉及两端部位重复测序结果均可重复后，再拼接并与NCBI上公共数据库比对分析。结果不同临床株的Rv0341编码基因1440bp片段序列与基因库结核分枝杆菌的相应序列完全相同，即未发现DNA的突变。其结果证实依R菌株的Rv0341蛋白高表达，不是其编码基因DNA的突变所致，而是受控于利福平的浓度。

实施例4：本发明的结核分枝杆菌蛋白用于依R菌的直接诊断的临床试验

依R菌株临床筛选和判断标准：具有在L-J绝对浓度间接法药敏培养中，其细菌在利福平(R)培养管(R₂₅₀μg/ml或R₅₀μg/ml)中菌落生长粗大旺盛，对照管中菌落细小、生长不良(呈L型生长)的结核分枝杆菌，被判定为依R菌(图1、2)。耐R菌则在含R管和对照管中细菌生长的旺盛程度(菌落外观形态)相同。

采用常规十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)技术对培养3-4周的结核分枝杆菌H₃₇Rv标准株、R敏感株、耐R株和依R株的菌体蛋白扫描图谱的比较分析的结果是：不同菌株的蛋白图谱条带数和位置基本相似。其中84％(41/49)的依R菌株在含R管中菌体蛋白表达丰富，且在相对于标准物分子质量43000的下端有一相同的高表达带；经全自动凝胶成像系统含量分析，该蛋白带约占总菌体蛋白的30％～50％。86％(72/84)的非依R菌株(30株R敏感菌和54株耐R菌)和H37Rv标准菌株的含R管和对照管的蛋白图谱相似，且无相应的高表达现象。依R菌等菌株的SDS-PAGE图谱如图14所示。其依R菌株的共同高表达蛋白带为结核分枝杆菌H₃₇Rv假设蛋白Rv0341，其氨基酸序列如序列2，鉴定方法如实施例3。

实验结果显示；利福平对依R菌Rv0341蛋白的表达有明显上调作用(诱导作用)，其上调Rv0341蛋白与依R菌相关，可视为依R菌的相关蛋白或标志物。

实施例5：本发明的结核分枝杆菌蛋白用于依R株结核病血清学诊断的临床试验

[方法]采用免疫印迹胶体金标记法血清抗体检测法。按实施例2制备本发明的结核分枝杆菌蛋白，固定于PVDV膜上。定位安装于测试板的反应孔中，质量检测后，4～8℃干燥保存备用。

[试剂盒组成]试剂盒组成包括：测试板、封闭液、洗涤液、金标试剂及阳性和阴性质控血清。

[检测步骤]

1.在测试板的反应孔中，加封闭液1滴，待其完全渗透于膜内。

2.取新鲜的待测血清50μl于反应孔中心，待其完全渗透于膜内。

3.加洗涤液3滴，待其完全渗透于膜内。重复洗涤1次。

4.加金标试剂1滴，待其完全渗透于膜内。

5.加洗涤液3滴，待其完全渗透于膜内，肉眼观察结果。

[结果判断]

阳性：在反应孔中的膜上出现红色斑点条带。如图14左。

阴性：在反应孔中的膜上没有红色斑点条带或有条带痕迹。如图14右。

[质量控制]每个批次试剂盒配有阳、阴性质控血清，用于监测试剂盒质量。阳、阴性质控血清结果可靠时，方可用于临床样本的检测。

[方法学实验结果]

从典型依R菌肺结核患者中成功获得抗依R菌Rv0341蛋白的抗体阳性血清。30份正常人血清抗体检测均为阴性。30份阴性血清和30份阳性血清的批内平行重复实验结果均相同。10份阴性血清的3次批间重复实验结果均为阴性；10份阳性血清的3次批间重复实验结果均为阳性，其阳性程度有一定的差异，以新培养菌株制备Rv0341蛋白带膜的阳性程度较强。

[327份血清抗体的检测结果]

327份血清源于重庆市肺科医院——重庆市结核基因诊断中心实验室血清库。检测结果见表1。

表1  327份血清抗体的检测结果

  N  抗体阳性(敏感性％)  抗体阴性(特异性％)  依R菌肺结核R治疗组  依R菌肺结核未用R组  耐R菌肺结核组  R敏感菌肺结核组  培养阴性结核组  非结核肺部疾病组  正常人组  合计：  30  12  31  36  147  41  30  327  26(86.7)  3(25.0)  2  6  29(19.7)  1  0  4  9  29(93.5)  30(83.3)  118  40(97.6)  30(100.0)

检测结果显示：本发明结核分枝杆菌蛋白建立的免疫印迹胶体金标记血清抗体检测法，有较好的批内批间重复性，其方法比较稳定。该法在正常人组、耐R菌肺结核组、R敏感菌肺结核组和非结核肺部疾病组的特异性分别为100％(30/30)、93.5％(29/30)、83.3％(30/36)和97.6％(40/41)，平均为93.5％(129/138)。在依R菌肺结核R治疗组中的敏感性为86.7％(26/30)。近期未使用R治疗组的12例依R菌肺结核患者的血清抗体仅检测到3例阳性(25.0％)，其结果基本与体外实验相符。即依R菌在没有R的条件下生长不良，目标蛋白不能进行有效表达，抗依R菌蛋白抗体在体内维持的时间，取决于被诱导的依R菌蛋白的量和在体内维持的时间。在培养阴性结核组中，获得了19.7％(29/147)阳性率，其中复难治病例13例，初治16例(包括颈淋巴结核2例、腹膜结核2例和血播性结核1例)，且29例患者均使用含R的治疗方案，其中已经治疗3-6月，而疗效不佳的6例，病情加重的3例，临床和实验结果均提示这些患者可能为依R菌结核病。另外，6例抗体阳性的R敏感肺结核病例的体内是否同时存在依R菌的问题值得证实(已知研究和临床结果均提示同一病例体内的结核分枝杆菌存在不均一性，即可能同时存在不同耐药情况的菌株)，其病例的临床疗效和细菌学资料的追踪研究正在进行。

综上所述，用包含本发明所指的蛋白的试剂盒在临床诊断依赖利福平结核分枝杆菌结核病时，不但有较好的重复性、特异性和敏感性，还能够使检测系统操作简单快速，不需要特殊的仪器和条件，利于推广应用。制备方法中，采用在常规培养基中加入特定浓度的利福平培养依R菌，无不需特殊设备的情况下，低成本的诱导依R菌产生本发明蛋白。在目前临床结核病治疗方案广泛使用利福平的情况下，采用包含本发明蛋白的试剂盒可作为血清学快速筛检方法辅助诊断依R菌结核病，特别是对大部分在体外不能获得细菌学指标的菌阴结核病的诊断来说，更有临床应用价值。

                                     序列表

<110>重庆市肺科医院

<120>用于诊断依赖利福平结核分枝杆菌结核病的结核分枝杆菌蛋白

<130>Hypothetical protein RV0341[Mycobacterium tuberculosis H37Rv]

<160>4

<210>1

<211>479

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>对人工序列的描述：诱导的

<400>1

Met Thr Ser Leu Ile Asp Tyr Ile Leu Ser Leu Phe Arg Ser Glu Asp Ala Ala Arg Ser

1               5                   10                  15                  20

Phe Val Ala Ala Pro Gly Arg Ala Met Thr Ser Ala Gly Leu Ile Asp Ile Ala Pro His

                25                  30                  35                  40

Gln Ile Ser Ser Val Ala Ala Asn Val Val Pro Gly Leu Asn Leu Gly Ala Gly Asp Pro

                45                  50                  55                  60

Met Ser Gly Leu Arg Gln Ala Val Ala Ala Arg His Gly Phe Ala Gln Asp Val Ala Asn

                65                  70                  75                  80

Val Gly Pro Phe Gly Asp Ala Gly Ala Gly Val Ala Ser Val Ile Thr Thr Asp Val Gly

                85                  90                  95                  100

Ala Gly Leu Ala Ser Gly Leu Gly Ala Gly Phe Leu Gly Gln Gly Gly Leu Ala Leu Ala

                105                 110                 115                 120

Ala Ser Ser Gly Gly Phe Gly Gly Gln Val Gly Leu Ala Ala Gln Val Gly Leu Gly Phe

                125                 130                 135                 140

Thr Ala Val Ile Glu Ala Glu Val Gly Ala Gln Val Gly Ala Gly Leu Gly Ile Gly Thr

                145                 150                 155                 160

Gly Leu Gly Ala Gln Ala Gly Met Gly Phe Gly Gly Gly Val Gly Leu Gly Leu Gly Gly

                165                 170                 175                 180

Gln Ala Gly Gly Val Ile Gly Gly Ser Ala Ala Gly Ala Ile Gly Ala Gly Val Gly Gly

                185                 190                 195                 200

Arg Leu Gly Gly Asn Gly Gln Ile Gly Val Ala Gly Gln Gly Ala Val Gly Ala Gly Val

                205                 210                 215                 220

Gly Ala Gly Val Gly Gly Gln Ala Gly Ile Ala Ser Gln Ile Gly Val Ser Ala Gly Gly

                225                 230                 235                 240

Gly Leu Gly Gly Val Gly Asn Val Ser Gly Leu Thr Gly Val Ser Ser Asn Ala Val Leu

                245                 250                 255                 260

Ala Ser Asn Ala Ser Gly Gln Ala Gly Leu Ile Ala Ser Glylu Gly Ala Ala Leu Asn Gly

                265                 270                 275                 280

Ala Ala Met Pro His Leu Ser Gly Pro Leu Ala Gly Val Gly Val Gly Gly Gln Ala Gly

                285                 290                 295                 300

Ala Ala Gly Gly Ala Gly Leu Gly Phe Gly Ala Val Gly His Pro Thr Pro Gln Pro Ala

                305                 310                 315                 320

Ala Leu Gly Ala Ala Gly Val Val Ala Lys Thr Glu Ala Ala Ala Gly Val Val Gly Gly

                325                 330                 335                 340

Val Gly Gly Ala Thr Ala Ala Gly Val Gly Gly Ala His Gly Asp Ile Leu Gly His Glu

                345                 350                 355                 360

Gly Ala Ala Leu Gly Ser Val Asp Thr Val Asn Ala Gly Val Thr Pro Val Glu His Gly

                365                 370                 375                 380

Leu Val Leu Pro Ser Gly Pro Leu Ile His Gly Gly Thr Gly Gly Tyr Gly Gly Met Asn

                385                 390                 395                 400

Pro Pro Val Thr Asp Ala Pro Ala Pro Gln Val Pro Ala Arg Ala Gln Pro Met Thr Thr

                405                 410                 415                 420

Ala Ala Glu His Thr Pro Ala Val Thr Gln Pro Gln His Thr Pro Val Glu Pro Pro Val

                425                 430                 435                 440

His Asp Lys Pro Pro Ser His Ser Val Glu Asp Val Gly His Glu Pro Pro Val Thr His

                445                 450                 455                 460

Thr Pro Pro Ala Pro Ile Glu Leu Pro Ser Tyr Gly Leu Phe Gly Leu Pro Gly Phe

                465                 470                 475             479

<210>2

<211>1440

<212>DNA

<213>结核病的结核分枝杆菌H37Rv[Mycobacterium tuberculosis H37Rv]

<220>

<400>1

409360                                           a tgacctcgct tatcgattac

409381 atcctgagcc tgttccgcag cgaagacgcc gcccggtcgt tcgttgccgc tccgggacgg

409441 gccatgacca gtgccgggct gatcgatatc gcgccgcacc aaatctcatc ggtggcggcc

409501 aatgtggtgc cgggtctgaa tctgggtgcc ggcgacccca tgagcggatt gcggcaggcc

409561 gtcgccgctc ggcatggctt tgcgcaggac gtcgccaatg tcggcttcgc cggtgacgcg

409621 ggcgcggggg tggcaagcgt catcacgacc gatgtcggtg cgggcctggc tagcggactg

409681 ggtgctgggt tcctgggtca gggtggcctg gctctcgccg cgtcaagcgg tggtttcggc

409741 ggtcaggtcg gcttggctgc ccaggtcggt ctgggtttta ctgccgtgat tgaggccgag

409801 gtcggcgctc aggttggtgc tgggttaggt attgggacgg gtctgggtgc tcaggccggt

409861 atgggctttg gcggcggggt tggcctgggt ctgggtggtc aggccggcgg tgtgatcggt

409921 gggagcgcgg ccggggctat cggtgccggc gtcggcggtc gcctaggcgg caatggccag

409981 atcggagttg ccggccaggg tgccgttggc gctggtgtcg gcgctggtgt cggcggccag

410041 gcgggcatcg ctagccagat cggtgtctca gccggtggtg ggctcggcgg cgtcggcaat

410101 gtcagcggcc tgaccggggt cagcagcaac gcagtgttgg cttccaacgc aagcggccag

410161 gcggggttga tcgccagtga aggcgctgcc ttgaacggcg ctgctatgcc tcatctgtcg

410221 ggcccgttag ccggtgtcgg tgtgggtggt caggccggcg ccgctggcgg cgccgggttg

410281 ggcttcggag cggtcgggca cccgactcct cagccggcgg ccctgggcgc ggctggcgtg

410341 gtggccaaga ccgaggcggc tgctggagtg gttggcgggg tcggcggggc aaccgcggcc

410401 ggggtcggcg gggcacacgg cgacatcctg ggccacgagg gagccgcact gggcagtgtc

410461 gacacggtca acgccggtgt cacgcccgtc gagcatggct tggtcctgcc cagtggcccc

410521 ctgatccacg gcggtaccgg cggctatggc ggcatgaacc cgccagtgac cgatgcgccg

410581 gcaccgcaag ttccggcgcg ggcccagccg atgaccacgg cggccgagca cacgccggcg

410641 gttacccaac cgcagcacac gccggtcgag ccgccggtcc acgataagcc gccgagccat

410701 tcggtgtttg acgtcggtca cgagccgccg gtgacgcaca cgccgccggc gcccatcgaa

410761 ctgccgtcgt acggcctttt cggactaccc gggttctga 410799

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对人工序列的描述：上游引物

<400>3

CGATTACATCCTGAGCCTGTT

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对人工序列的描述：下游引物

<400>3

GGTAGTCCGAAAAGGCCGTA