多次食管酸灌注对哮喘小鼠气道TRPV1受体及炎症反应的影响

摘要

目的：⑴建立胃食管反流(gastroesophageal reflux，GER)及哮喘小鼠模型；⑵观察TRPV1（Transient receptor potential vanilloid-1）在胃食管反流小鼠、哮喘小鼠、胃食管反流合并哮喘小鼠表达的不同及对炎症反应的影响；⑶研究TRPV1在GER导致哮喘发生发展中的可能机制，为哮喘研制新型的治疗药物及早期干预提供重要的理论依据。 方法：60只8-9周龄的雄性BALB/c小鼠，随机分成6组（正常组、灌盐组、灌酸组、哮喘组、哮喘灌盐组、哮喘灌酸组），用鸡卵白蛋白（Ovalbumin，OVA腹腔注射及雾化建立哮喘模型。用食管下段盐酸灌注建立GER模型，灌盐组用生理盐水代替稀盐酸灌注。最后一次抗原激发后24小时处死小鼠。小鼠血清检测BRP-39（鼠软骨糖蛋白）;回收肺泡灌洗液(BALF, Bronchoalveolar lavage fluid)检测BRP-39及P物质(Substance P，SP); BALF细胞沉渣涂片后染色行细胞总数及分类计数;肺组织匀浆检测SP。用ELISA检测BRP-39、SP水平;HE染色观察食管及肺组织的病理组织改变;免疫组化及荧光定量PCR检测TRPV1受体蛋白及mRNA在小鼠肺组织中的表达及分布情况。 结果：①BALF液细胞总数及分类计数:单纯哮喘组及哮喘灌盐、哮喘灌酸组小鼠BALF中细胞总数较正常对照组高，嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的细胞分类数均较对照组高，以嗜酸性粒细胞增高最为明显，具有统计学意义(P＜0.05);灌酸组小鼠BALF中细胞总数较对照组高，中性粒细胞和淋巴细胞的细胞分类数均较对照组高，但以中心粒细胞增高最为明显，具有统计学差异(P＜0.05)，嗜酸性粒细胞与对照组比较无明显变化。②肺组织切片HE染色:正常对照组及灌盐组小鼠:肺组织形态正常、结构完整，未见明显的炎症细胞浸润。建立哮喘造模的三组小鼠:支气管粘膜皱壁增多卷曲、管腔狭窄，气管和血管周围可见大量的炎性细胞浸润，巨噬细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞增多，粘膜充血水肿。肺泡、气道结构破坏，气道上皮细胞脱落，气道内有粘液及脱落的粘膜上皮。其中，哮喘灌酸组的炎症表现最明显，哮喘组和哮喘灌盐组肺组织病理改变无明显差异。胃食管反流模型小鼠（包括单纯灌酸组、哮喘灌酸组）肺部表现出明显的炎症反应，食管灌酸组与哮喘造模组小鼠不同的是，血管、气管周围的炎症细胞主要是巨噬细胞、淋巴细胞，嗜酸性粒细胞并不明显。③食管切片HE染色:食管非灌酸小鼠（包括正常对照组、灌盐组、哮喘组、哮喘灌盐组）食管黏膜光滑，层次结构清晰，未见粘膜、肌层、固有层、上皮发生组织学变化。胃食管反流模型组小鼠（包括单纯灌酸组、哮喘灌酸组）食管粘膜层增生不明显，部分食管有鳞状上皮增生现象，固有层中性粒细胞等浸润，粘膜下层内可见血管扩张、充血，但未见明显的溃疡形成。④免疫组化标记TRPV1在各组小鼠肺组织中的表达显示:TRPV1在小鼠肺组织的气管上皮细胞胞浆及伴随血管内皮、血管肌纤维、炎症细胞上均有表达，显示棕黄色。灌酸组及哮喘组表达明显，且哮喘灌酸组表达尤其突出。⑤SP及BRP-39浓度变化:BALF液及肺组织匀浆液中检测SP浓度:正常组与灌盐组小鼠，哮喘灌盐组与哮喘灌酸组小鼠无统计学差异。哮喘灌酸组与灌酸组小鼠比哮喘组高(P＜0.05)。BALF液及血中检测BRP-39浓度:正常组与灌盐组小鼠，哮喘灌盐组与哮喘灌酸组小鼠无统计学差异。哮喘组、哮喘灌酸组均比灌酸组高（P值分别＜0.05及＜0.001）。⑥Q-PCR检测:与正常组相比，除灌盐组外其余各组小鼠肺TRPV1 mRNA表达均有上调(P＜0.05)，灌酸组上调比哮喘组明显，而哮喘灌酸组上调最为明显(P＜0.001);哮喘组与哮喘灌盐组之间无明显差异(P＞0.05)。 结论：⑴灌酸组小鼠食管病理组织改变符合轻中度反流性食管炎的诊断标准，通过本实验的灌酸方法成功建立胃食管反流模型。多次食管酸灌注可引起小鼠肺部的炎症改变，但以中性粒浸润为主，与过敏性哮喘特征性改变不同。⑵推测GER导致正常或哮喘小鼠肺部炎症改变的机制可能与SP介导的神经源性炎症及肺部TRPV1受体的激活有关。

目录

声明

摘要

1 前言

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法及步骤

3 实验结果

4 讨论

5 结论

参考文献

综述 TRPV1在呼吸系统疾病中的研究进展

致谢

附录一：缩写词中英文对照

附录二：在读期间的科研情况