缺氧诱导因子-1a基因转染人间充质干细胞的体内促血管生成作用研究

摘要

目的:研究缺氧诱导因子-1α(hypoxia-induciblefactor1α，HIF-1α)基因转染人间充质干细胞(humanmesenchymalstemcells，hMSCs)的体内促血管生成作用，为促进组织工程骨血管化提供新的方法和策略。 方法:1.HIF-1α基因转染人间充质干细胞：将构建的pIRES3/HIF-1α逆转录病毒载体转染PT67包装细胞，制备含目的基因的重组逆转录病毒液，感染hMSCs，获得稳定高表达HIF-1α的hMSCs。用RT-PCR法检测转基因hMSCs表达HIF-1α的水平，用免疫组化法检测转基因hMSCs在缺氧和常氧条件下HIF-1α蛋白的存在情况。 2.转基因hMSCs体内促血管生成的研究：将转基因hMSCs和未转基因的hMSCs分别接种到13d的鸡胚绒毛尿囊膜(chickenchorioallantoicmembrane，CAM)，3d后在解剖显微镜下原位观察并拍摄血管，然后将CAM用Bouin's液固定，制片，在显微镜下观察并摄像。用Image-ProPlus4.5测量并分析血管面积。 结果:1.感染后的hMSCs经G418筛选后逐渐形成克隆，克隆中的hMSCs均表达EGFP，在倒置荧光显微镜下可见明亮的绿色荧光。 2.缺氧条件下，转基因hMSCs中HIF-1αmRNA表达较未转基因的hMSCs明显增高。 3.免疫组化法检测HIF-1α蛋白结果显示：缺氧组转基因hMSCs细胞核内呈棕黄色，染色结果为阳性；常氧组转基因hMSCs细胞核未着色，染色结果为阴性。 4.CAM原位观察：对照组CAM细胞团周围血管走行稍曲折，血管生成不明显；实验组CAM细胞团周围出现大量新生血管，以细胞团为中心呈放射状排列。 5.CAM标本显微镜下观察：实验组CAM可见大量新生血管以细胞团为中心呈放射状排列形成辐条轮状。此外，细胞团内部可见密集的新生血管网。对照组细胞团周围无明显血管生成。试验组CAM血管密度较对照组明显增高。 6.图像分析结果显示实验组CAM较对照组CAM血管面积明显增多，有显著的统计学差异(P＜0.01)。 结论:1.HIF-1α基因能稳定转染人间充质干细胞并得到强制表达。 2.转染HIF-1α基因的hMSCs，缺氧条件下细胞核内HIF-1α能稳定存在；常氧条件下细胞核内HIF-1α不能稳定存在，。表明利用转基因hMSCs促进血管生成具有较好的可调控性。 3.转染HIF-1α基因的hMSCs有明显的促血管生成作用。 4.利用HIF-1α基因的高表达来促进组织工程骨血管化的策略具有一定的可行性。

目录

第三军医大学研究生学位论文独创性声明及学位论文版权使用授权书

英文缩写一览表

前言

第一部分缺氧诱导因子-1a基因转染人间充质干细胞

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分转染缺氧诱导因子-1 α基因的人间充质干细胞体内促血管生成作用的研究

材料与方法

结果

讨论

小结

全文结论

致谢

图片1

图片2

图片3

参考文献

文献综述缺氧诱导因子-1a的活性调控

研究生期间发表论文