家蝇幼虫中耐热DNase样活性蛋白的鉴定及其cDNA的克隆与表达

摘要

在转基因家蝇的研究中，我们发现了一种热稳定的具有DNase样活性的蛋白质。该蛋白在80℃加热20min后，仍然具有降解质粒DNA的核酸内切酶活性。为了对此蛋白的生物学特性进行深入的研究，我们拟利用现代生物学技术，首先提取纯化少量目的蛋白，通过肽质量指纹图谱分析确定其身份；然后根据GenBank中相关序列信息设计引物，克隆该蛋白的全长cDNA；最后构建不同的表达载体，在不同的宿主细胞中进行表达，并对表达产物的生物学活性进行鉴定。 首先，利用DEAE-52离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤层析等蛋白质纯化技术，从家蝇幼虫中提取纯化到一种耐热的具有DNase样活性的蛋白质。通过肽质量指纹图谱分析，并结合该蛋白与L-DOPA特异性的显色反应，初步证明这种耐热DNase样活性蛋白是酚氧化酶。 根据GenBank中收录的家蝇酚氧化酶原DNA序列设计引物，利用RT-PCR技术，从家蝇幼虫总RNA中克隆了酚氧化酶原(PPO)及酶(P0)的全长cDNA。经序列分析得知：它们完整的开放阅读框长度分别为2052 bp和1908 bp，分别编码683和635个氨基酸。与GenBank中收录的家蝇幼虫酚氧化酶原及酶的cDNA分别具有97％、97-3％同源性，氨基酸序列的同源性为98.5％、98.9％。 分别构建了原核表达载体pET-PO<,12>和pET-PPO<,12>，在人肠杆菌中进行了表达研究。RT-PCR检测证明，家蝇幼虫酚氧化酶及酶原的cDNA在大肠杆菌中得NT转录，但SDS-PAGE未检测到目的蛋白的表达。 构建了真核表达载体pVAX1-PO<,34>和pVAX1-PPO<,34>，通过脂质体法转染HeLa和MDCK细胞，进行了表达研究。经Western Blot检测，证明了家蝇幼虫酚氧化酶及酶原在HeLa细胞中实现了表达。表达产物在80℃加热20 min后，仍然具有DNase样活性，表现出和提取的家蝇幼虫酚氧化酶相同的生物学特性。 我们的研究证明，家蝇幼虫酚氧化酶除了氧化活性外，还具有热稳定的DNase样活性，是一种双功能酶。这一发现预示了酚氧化酶可能在免疫系统中扮演着其他重要的角色，为酚氧化酶确切生理功能的研究提供启发和借鉴。 同时，我们利用SMART技术构建了家蝇幼虫的cDNA文库，原始文库的滴度为1.31×10<'5>cfu/mL，重组率为90％，插入片段长度分布范围为400～3000 bp，为筛选家蝇幼虫的cDNA基因建立了良好的平台。

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文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

第一部分文献综述

第二部分实验内容

实验一家蝇幼虫中耐热DNase样活性蛋白的鉴定

1.1材料与方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

实验二家蝇幼虫酚氧化酶及酶原cDNA克隆与序列分析

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

实验三家蝇幼虫酚氧化酶及酶原在大肠杆菌中的表达研究

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

实验四家蝇幼虫酚氧化酶及酶原在真核细胞中的表达研究

4.1材料和方法

4.2结果

4.3讨论

4.4小结

实验五家蝇幼虫cDNA文库的构建

5.1材料与方法

5.2结果

5.3讨论

5.4小结

结论

展望

参考文献

致谢

附录

个人简介