黄曲霉毒素B1抗体的制备及其胶体金检测试纸条的研制

摘要

黄曲霉毒素B1广泛存在于粮食作物和饲料中，是迄今为止发现的最强的致癌物质之一，其毒性要远远高于氰化物、有机农药等，严重威胁了人类和动物的生命安全。目前黄曲霉毒素B1检测方法大多依靠液相色谱等昂贵的仪器来进行，不利于现场检测，而且需要专业的检测人员来操作仪器，花费时间久且检测费用高。因此，研究出适合现场检测且时间短、费用低的检测方法具有重要的意义。 黄曲霉毒素B1属于小分子化学物，不能采用直接免疫动物的方法来获取多克隆抗体。抗原合成首先利用羧甲基羟胺半盐酸盐进行黄曲霉毒素B1的改造，使其在碳三位置连接上羧基。2mg AFB1于2mL吡啶甲醇(V/V1∶3)溶液中直接在室温下进行反应，生成肟化物AFB1-O，利用薄层层析、紫外扫描和质谱进行AFB1-O的鉴定，得到其紫外吸收峰为209、220、264、360nm，AFB1的利用率为85.7％。AFB1-O在EDC或者DCC的作用下与牛血清白蛋白、鸡蛋清白蛋白进行偶联，得到免疫原AFB1-O-BSA和包被原AFB1-O-OVA。 利用免疫原AFB1-O-BSA免疫小鼠，得到多抗血清，利用辛酸-硫酸铵盐析及透析法进行纯化，纯化后血清经过SDS-PAGE电泳显示为2条带。采用间接ELISA方法测定血清效价，6只小鼠的效价均在6000以上，其中3号小鼠的效价为10000以上，抗体浓度为1.37mg/mL，IC-ELISA标准曲线为y=-43.50x+99.37(R2=0.988)，IC50为12.59ng/mL。 以柠檬酸钠还原氯金酸来制备胶体金。以反应时间、反应pH、转速进行50mL0.01％氯金酸中加入1％柠檬酸钠2mL进行正交实验，得出最优反应条件为不加入酸碱物质，转速为100r/min，沸腾后反应10min条件下制备出来的胶体金良好，电镜下观察粒子平均直径为14.6nm，紫外吸收峰为518.5nm。通过计算得到粒子浓度为6.8×1010个/cm3，摩尔浓度为1.13×10-10mol/L，每个胶体金粒子中含有9.64×105个金原子，其胶体金临界絮凝浓度为0.8g/mL。 试纸条主要由样品垫、金标垫、NC膜和吸水纸等组成。利用目测法和光电比色法确定了最适抗体标记量和最适pH，稳定1mL胶体金最适抗体稳定量为55.2μg，1mL胶体金中加入12μL浓度为0.1mol/L碳酸钾时为最适pH。制备好的金标探针进行可见光扫描，其吸收峰为528.5nm。采用浸金法制备金标垫，检测线划上浓度为1mg/mL AFB1-O-OVA，质控线划上浓度为1.2mg/mL羊抗鼠二抗。组装试纸条后经过测定，得到组装后的试纸条的灵敏度为150ng/mL。

目录

声明

摘要

主要符号表

第1章 引言

1．1 黄曲霉毒素简介

1．1．1 黄曲霉毒素化学结构

1．1．2 黄曲霉毒素的毒性

1．1．3 黄曲霉毒素限量标准

1．2 黄曲霉毒素生物合成途径

1．3 黄曲霉毒素B1在生物体内代谢的途径

1．4 黄曲霉毒素B1去除方法

1．4．1 物理化学方法

1．4．2 生物降解方法

1．5 黄曲霉毒素检测方法

1．5．1 薄层色谱法

1．5．2 高效液相色谱法

1．5．3 液相-质谱(LC-MS)联用法

1．5．4 黄曲霉毒素B1酶联定量检测试剂盒法

1．5．5 胶体金免疫层析快速检测方法

1．6 选题目的、研究内容及其创新点

1．6．1 选题目的

1．6．2 论文研究内容

1．6．3 论文创新点

第2章 黄曲霉毒素B1人工抗原的制备及其鉴定

2．1 实验材料

2．1．1 药品试剂

2．1．2 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 肟化物的制备

2．2．2 肟化物的鉴定

2．2．3 人工抗原的制备

2．2．4 人工抗原分析与鉴定

2．3 实验结果

2．3．1 肟化物的鉴定

2．3．2 人工抗原分析与鉴定

2．4 讨论

2．5 本章小结

第3章 黄曲霉毒素B1抗体的制备

3．1 实验器材

3．1．1 药品试剂

3．1．2 仪器设备

3．1．3 主要溶液

3．1．4 实验动物

3．2 实验方法

3．2．1 抗血清的制备

3．2．2 抗血清的纯化

3．2．3 SOS-PAGE分析纯化血清

3．2．4 酶标抗体的制备

3．2．5 多抗血清效价测定

3．2．6 多抗血清蛋白浓度测定

3．2．7 多抗血清敏感性测定

3．2．8 抗血清特异性实验

3．3 实验结果

3．3．1 酶标抗体鉴定

3．3．2 SDS-PAGE分析纯化血清

3．3．3 多抗血清效价测定

3．3．4 多抗血清蛋白浓度

3．3．5 多抗血清敏感性测定

3．3．6 抗血清特异性实验

3．4 讨论

3．5 本章小结

第4章 胶体金的制备及其表征研究

4．1 实验材料

4．1．1 药品试剂

4．1．2 仪器设备

4．2．实验方法

4．2．1 胶体金制备

4．2．2 柠檬酸钠制备胶体金单因素实验

4．2．3 胶体金制备正交实验

4．2．4 胶体金鉴定与分析

4．3 实验结果

4．3．1 柠檬酸钠制备胶体金单因素实验

4．3．2 正交实验分析

4．3．3 胶体金分析

4．4 讨论

4．5 本章小结

第5章 黄曲霉毒素B1胶体金检测试纸条的研制

5．1 实验材料

5．1．1 药品试剂

5．1．2 仪器设备

5．1．3 实验耗材

5．2 实验方法

5．2．1 金标探针的制备

5．2．2 金标探针的鉴定与分析

5．2．3 样品垫的制各

5．2．4 金标垫的制备

5．2．5 NC膜划线

5．2．6 试纸条的组装与结果判断

5．2．7 试纸条的性能测定及其应用

5．3 实验结果

5．3．1 金标探针的制备

5．3．2 金标探针的鉴定与分析

5．3．3 样品垫的处理

5．3．4 金标垫的处理与制备

5．3．5 NC膜划线

5．3．6 试纸条性能测试

5．4 讨论

5．5 本章小结

第6章 结论与展望

6．1 全文结论

6．2 展望

致谢

参考文献

在学期间发表的学术论文