基于胶体金免疫层析技术制备快速检测中药中黄曲霉毒素B1试纸条的研究

摘要

目的：基于胶体金免疫层析技术制备一种快速检测莲子、当归、姜粉、陈皮、西洋参、白芍中黄曲霉毒素B1(AFB1)的试纸条，以期建立简单、快速、经济、高效的黄曲霉毒素氏的检测方法。
　　方法：①采用酶联免疫吸附法(ELLISA)对制备抗AFB1单克隆抗体效价评估；②采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，制备的胶体金溶液经目测法、透射电镜扫描法、紫外分光光度计法观察金颗粒分散均匀程度及测定平均粒径大小；③采用间接竞争胶体金免疫层析技术(Indirect competitive colloidal gold immune chromatography technology，ICGT),优化纳米金标记抗体最佳偶联浓度、金标抗体最佳偶联pH和包被在硝酸纤维素膜(NC)上AFB1-BSA(检测线）和二抗羊抗鼠IgG(控制线)浓度；④采用滴加标品溶液法，确定免疫层析试纸条的最低检测限，考察试纸条的性能（特异性、稳定性及重现性);⑤采用试纸条检测法对市售莲子、当归、姜粉、陈皮、西洋参、白芍样品中AFB1初筛，并采用UFLC-MS/MS法分别对市售6种中药样品中AFB1的含量进行测定。
　　结果：①试纸条制备的研宄结果显示：当制备AFB1单克隆抗体浓度为3.8mg/mL，酶联免疫吸附法(ELLISA)抗体效价1:1.0×104时，IC50为0.01ng/mL的时候，抗体效价良好；胶体金溶液在528nm处有最大吸收波长，金颗粒的平均粒径约为400nm；胶体金标记抗体最佳标记浓度为6μg/mL/在pH8.2下，抗体与胶体金偶联结果最佳，NC膜上最佳吸附抗原浓度(AFB1-BSA，检测线）为0.3mg/mL，二抗羊抗鼠（IgG，控制线)最佳吸附浓度为0.5mg/mL；制备的试纸条最低检测限为2.5ng/mL，检测时间10min，对试纸条特异性的考察结果显示，其性能良好。
　　②试纸条对6种中药中AFB1初筛结果显示：6份莲子、9份当归、23份姜粉、1份白芍、9份陈皮药材样品中，检测出AFB1。且含量超过2.5ng/mL，10份西洋参样品中未检测出阳性样品。
　　③LC-MS/MS定量分析结果显示：6份莲子样品呈阳性，AFB1的含量分布范围在：4.37-7.82μg/kg；9份当归样品呈阳性，AFB1的含量分布范围在：3.85-10.82μg/kg；23份姜粉样品呈阳性，AFB1的含量分布范围在:2.53-6.82μg/kg；1份白芍样品呈阳性，AFB1的含量分布范围在：2.75μg/kg;9份陈皮样品呈阳性，AFB1的含量分布范围在：2.90-10.21μg/kg；西洋参样品中未检测出阳性样品或低于定量限。
　　试纸条的检测结果与LC-MS/MS结果相比较，提示制备的试纸条灵敏度、稳定性良好，能够满足部分中药中黄曲霉毒素B1初步筛查的目的。
　　结论：本研宄所制备的快速检测中药中AFB1的试纸条具有经济合理、操作简便、结果直观、灵敏度高的优点。与常规的AFB1分析方法相比，试纸条检测省略了繁琐的操作步骤和昂贵的仪器设备。能满足中药材的实时、实地快速检测目的。同时，为建立中药材中AFB1的快速筛查方法提供了参考和依据。
　　但是，由于中药化学成分复杂，基质干扰严重，制备的免疫层析试纸条仅适用于组分与AFB1结构差异性较大中药快速检测。因此，优化示踪物标记免疫蛋白，提高试纸条检测特异性、灵敏度也是今后值得研宄的重点。

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缩略词英汉注释表

引言

实验研究一 黄曲霉毒素B1试纸条制备及性能测定

1实验仪器及材料

2抗AFB1单克隆抗体的制备

3应用胶体金免疫层析技术制备AFB1试纸条

实验研究二 试纸条快速检测中药AFB1初筛验证及与LC-MS/MS法比较研究

1仪器与试剂

2胶体金免疫层析检测法与LC-MS/MS法的比较

讨论

1中药材真菌毒素快筛必要性

2免疫层析试纸条制备的影响因素

3试纸条筛查与LC-MS/MS测定结果比较分析

4免疫层析技术与常规分析技术比较

结论

问题与展望

综述

1 黄曲霉毒素的简介

2胶体金免疫层析技术的研究进展

3中药材选取依据

4研究黄曲霉毒素检测方法的目的及意义

5本课从组前期的研究基础

致谢

参考文献

在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果

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