慢病毒介导的鸡BCRP稳定表达MDCK细胞系构建及其应用

摘要

目的：本研究通过慢病毒载体系统构建了稳定表达鸡BCRP的MDCK细胞系MDCK-chBCRP,为鸡BCRP底物筛选及药物间相互作用研究奠定基础. 方法：试验首先构建含鸡BCRP慢病毒的表达载体并转染293T细胞得到含鸡BCRP的慢病毒.所得病毒感染MDCK细胞,经含1μg/mL的嘌呤霉素培养液筛选后得到稳定表达鸡BCRP转运体的MDCK细胞模型MDCK-chBCRPo Western Blot、荧光显微镜和流式法检测BCRP蛋白表达.对BCRP经典底物米托蒽醌的敏感性及蓄积能力进行蛋白功能的验证.最后运用构建好的细胞系对鸡常用药物进行BCRP底物的筛选. 结果：成功构建了含鸡BCRP慢病毒的表达载体,并通过转染293T细胞后获得滴度为2.77x106IU/mL的慢病毒.Western Blot、荧光显微镜和流式法检测结果显示鸡BCRP蛋白高表达于MDCK细胞系.米托蒽醌的敏感性及蓄积能力实验结果显示,转染BCRP基因后MDCK细胞对米托蒽醌耐药性明显提高(P＜0.01),并且BCRP蛋白能显著高效外排BCRP底物米托蒽醌(P＜0.05),显示良好的生物活性功能.底物筛选结果显示替米考星、氟苯尼考的净外排率大于2,可能是是鸡BCRP底物,恩诺沙星、阿莫西林的净外排率小于2,可能不是鸡BCRP底物. 结论：成功构建了稳定表达鸡BCRP的MDCK细胞系,并可用于鸡BCRP底物的筛选.