Calmodulin及其突变体与去磷酸化的Cav1.2钙通道片段CT1的结合情况

摘要

目的：研究Calmodulin(CaM)及其突变体与去磷酸化CT1的结合情况.rn 方法：本实验中研究的CaM突变体包含CaM12(N-lobe上的两个Ca2+结合发生突变)、CaM34(C-lobe上的两个Ca2+ 结合发生突变)和CaM1234(以上Ca2+结合均发生突变).将CaM及其突变体的eDNA插入pGEX-6p-3质粒载体后,转化Escherichia coli BL21感受态细胞,大量培养并利用IPTG诱导CaM及其突变体的GST融合蛋白表达,采用超声法破碎大肠杆菌,释放蛋白,利用GS-4Bbeads进行分离纯化,采用SDS-PAGE检测目的蛋白纯度和相对分子量,Bradford方法测定纯化后蛋白浓度.rn 结果：经15%SDS-PAGE电泳检测，在表观分子量约为18kD处出现蛋白条带，表明去磷酸化后的CT1可与CaM及突变体结合，但结合量均低于正常状态CT1与CaM及突变体的结合。实验结果显示，与正常状态CTl和野生型CaM的结合作用相比，去磷酸化后GSTCT1与野生型CaM结合量减少63.1，与正常状态CT1和CaM12, CaM34,CaM1234相比，去磷酸化后GSTCT1与突变体CaM12结合量减少88.2%，与突变体CaM34结合量减少20.4，与突变体CaM1234结合量减少13.4。rn 结论：CaM及其突变体可特异性地与去磷酸化后的CT1结合，但结合作用减弱，其中CaM及CaM12结合作用减弱的最为明显。