Rhodococcus sp.R04水解酶BphD的定向进化及其突变酶的性质研究

摘要

BphD（2-羟基-6-氧-6-苯基-2，4-己二烯酸水解酶）是一种多氯联苯微生物降解途径中的关键酶。它负责催化2-羟基-6-氧-6-苯基-2，4-己二烯酸（2-hydroxyl-6-oxo-6-phenylhexa-2，4-dienoicacid，HOPDA）C-C键的断裂，生成2-羟基-2，4-戊二烯酸(2-hydroxypenta-2，4-dienoicacid，HPD)以及苯甲酸。近年来，对该水解酶结构、功能及催化机制的研究已经成为该领域研究的热点。
　　 本文以酶切质粒获得的bphD基因作为源基因，利用体外定向进化技术对其进行改造，以获得性能更为优良的产酶菌株。采用DNAshuffling技术成功构建了BphD突变文库，并利用96孔板活性筛选法对该突变库进行初步筛选，最终获得了6株酶活力较高的突变株:E.coliDH5α/pBV220-bphD30、E.coliDH5α/pBV220-bphD41、E.coliDH5α/pBV220-bphD45、E.coliDH5α/pBV220-bphD48、E.coliDH5α/pBV220-bphD49和E.coliDH5α/pBV220-bphD53。序列分析发现，在BphD一级结构序列中，Q20-R是突变频率最高的位点，而突变较为集中的区段为氨基酸序列的1-20及40-120。
　　 将BphD及突变酶的基因分别克隆到表达载体pET21a中。表达产物经QSepharose离子柱和PhenylFF疏水柱两步纯化，得到了纯度较高的酶。在此基础上，对BphD及突变酶的比活、热稳定性及稳态动力学参数进行了比较研究。结果表明，这6株突变酶的热稳定性与野生型基本一致（T1/230min约为62.5℃）;突变体30#、41#、45#、48#、49#及53#对底物的亲和力较野生型分别提高了19.31、2.8、3.04、2.14、2.3和1.34倍，转化效率分别提高了16.56、2.26、3.53、2.95、2.84和1.56倍。
　　 我们对该水解酶进行了定点突变(Pro-aa)，并研究了脯氨酸突变对BphD的表达量、酶活性、热稳定性、圆二色谱及荧光光谱的影响。结果表明，突变酶P43G、P145A、P163A、P214E、P241A、P253L和P43G/P163A的可溶性表达量均较野生型的低。脯氨酸突变酶的酶活均较野生型的低，其中突变酶P43G和P43G/P163A酶活分别降低了4.23和28.15倍。突变酶P43G/P163A的T1/220min仅为51℃，较野生型降低了13℃;其次是突变酶P241A、P145A、P253L、P43G、P161、P163A、P179Q及P214E，较野生型分别降低了9、6、6、4、3、3、3和1℃。突变体的圆二色谱(CD谱)分析表明:与野生型相比，突变体的二级结构没有发生改变;突变酶P43G/P163A、P241A、P253L、P161、P163A、P179Q、P214E、P145A及P43G的热变性中点温度(T1/2CD)分别较野生型降低了22、18.5、14、13、13、13、11、8.5及4℃。突变体的荧光光谱分析表明:脯氨酸突变后蛋白质的分子构象发生了变化。证明了脯氨酸突变影响了BphD的正确折叠、酶活性、热稳定性（T1/220min）、热变性中点温度（T1/2CD）及其分子构象;而将脯氨酸回复突变后，其酶学性质也会得到相应的恢复。可见，脯氨酸对维持联苯水解酶的结构和稳定性具有重要的作用。

目录

摘要

第一章 文献综述

1 Rhodococcus sp．R04水解酶

1．1 Rhodococcus sp．R04水解酶

1．2 Rhodococcus sp．R04水解酶的催化三联体

1．3 Rhodococcus sp．R04水解酶的研究进展

2 定向进化技术

2．1 突变体基因文库的构建

2．2 文库的筛选

2．3 定向进化的应用

3 蛋白质分子构象的测定方法

3．1 晶体蛋白质分子结构的测定

3．2 溶液中蛋白质分子构象的测定

4 本论文研究的目的和意义

参考文献

第二章 Rhodococcus sp．R04水解酶BphD的定向进化

1 材料

1．1 菌株和质粒

1．2 培养基

1．3 主要的酶和化学试剂

1．4 主要仪器设备

2 方法

2．1 DNA shuffling源基因的获得

2．2 DNase Ⅰ消化

2．3 无引物PCR

2．4 有引物PCR

2．5 突变文库的构建

2．6 DNA shuffling突变文库的筛选

3 结果与讨论

3．1 DNA shuffling源基因

3．2 DNase Ⅰ消化

3．3 DNA片段的重装配

3．4 有引物PCR

3．5 突变文库

3．6 DNA shuffling突变文库的初步筛选

4 小结

参考文献

第三章 BphD及突变酶的表达纯化和部分性质研究

1 材料

1．1 菌株与质粒

1．2 主要的酶和化学试剂

1．3 主要仪器设备

2 方法

2．1 BphD及突变体基因的克隆

2．2 BphD及突变体基因表达载体的构建

2．3 BphD及其突变酶的诱导表达及纯化

2．4 BphD及其突变酶的性质研究

3 结果与讨论

3．1 BphD及其突变酶的表达纯化

3．2 BphD及其突变酶的酶活

3．3 BphD及其突变酶的热稳定性

3．4 BphD及其突变酶的稳态动力学分析

4 小结

参考文献

第四章 脯氨酸突变对BphD性质的影响

1 材料

1．1 菌株与质粒

1．2 主要的酶和化学试剂

1．3 主要仪器设备

2 方法

2．1 BphD点突变体的构建

2．2 BphD及其突变酶表达量的分析

2．3 BphD及其突变酶的纯化

2．4 BphD及其突变酶的酶活性分析

2．5 BphD及其突变酶的热稳定性测定

2．6 BphD及其突变酶的圆二色性分析

2．7 BphD及其突变酶的荧光光谱分析

3 结果与讨论

3．1 BphD的定点突变

3．2 BphD及其突变酶的表达

3．3 BphD及其突变酶的纯化

3．4 BphD及其突变酶的活性

3．5 BphD及其突变酶的热稳定性

3．6 BphD及其突变酶的圆二色性(CD)

3．7 BphD及其突变酶的荧光光谱

4 小结

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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