一种定点突变改造的基因工程腈水解酶

摘要

本发明涉及通过基因工程改造得到的真菌腈水解酶。本发明所述的一种定点突变改造的基因工程腈水解酶，其特征在于所述定点突变的基因工程腈水解酶氨基酸序列相对于天然的真菌腈水解酶氨基酸序列的第144位Glu被敲除。本发明还公开了所述的基因工程腈水解酶的生产方法及其在烟酸合成中的应用。本发明所述的基因工程腈水解酶在催化活力方面更加优良，副产物酰胺的生成能力明显降低，为其在烟酸合成中的大规模、低成本的工业应用奠定了基础。

说明书

技术领域

 本发明属于基因工程领域，涉及一种定点突变方法制备具有改善的腈水解酶活性及降低的酰胺生成能力的基因工程真菌腈水解酶。其关键是真菌腈水解酶的定点改造、克隆、表达及产物的发酵表达及分离纯化制备，以及定点突变的基因工程菌在烟酸合成中的应用。

背景技术

自1964年哈佛大学学者Thimann等人首次在大麦叶中发现并分离到了一种植物蛋白，也就是所说的腈水解酶。它能有效地水解吲哚乙腈合成生长激素吲哚乙酸（Thimann等，Arch Biochem Biophys 1964, 105 (1):133-141）。至今为止已发现来源于细菌、丝状真菌、酵母及植物体中的腈水解酶产生机体上百种，他们能将苯甲腈、丙烯腈、乙腈、甘氨腈等腈类化合物转化为相应的有机酸及氨基酸，并且能应用于腈污染废水的生物除污以及纺织工业中聚合材料的表面修饰。其中一些高效的腈水解酶应用于工业规模的羧酸生产中也已经取得了良好效果，如广州龙沙的烟酸工业生产工艺及三菱化工的扁桃酸生产工艺都是非常成功的案例，这也充分体现了腈水解酶的应用潜力。相关的研究与开发使得腈水解酶在制药、食品、化工、环保等领域具有广阔的应用前景。

烟酸是维生素B3的前体，作为维生素类药物，可用于防治糙皮病等烟酸缺乏症；可用作血管扩张药，治疗高脂血症；也可用于治疗头痛、肺栓赛、冻伤等病症；作为医药中间体，烟酸可用于异烟肼、烟酰胺、烟酸肌醇酯等的生产；另外，烟酸的一个重要用途是可用做饲料添加剂。因此，目前市场需求量非常大。烟酸生产的传统工艺主要采用氨氧化法、气相氧化法及喹啶羟基化法等化学方法来进行生产（CN201210089804.4）。但是这些方法需要采用昂贵的催化剂进行反应，使用强酸碱使设备腐蚀严重，而且产率较低，使得产品的分离纯化难度加大，此外生产工艺过程对环境存在比较严重的污染（CN101550432）。

采用绿色环保的生物催化工艺进行烟酸生产在近年来受到了极大的关注。生物催化法反应条件温和、催化剂特异性高、选择性强、能耗少、催化剂制作成本低廉、工艺环境友好。这是化学生产工艺所无法比拟的。

自上世纪80年代后期以来，全球已有多家机构开展了腈水解酶催化法制备烟酸工艺的研究。至今已有来自不同单位的学者分别采用细菌归属的玫瑰红球菌Rhodococcus rhodochrous J1（Mathew等，Appl Environ Microbiol1988, 54 (4):1030-1032），苍白芽孢杆菌Bacillus pallidus （Almatawah等，Enzyme Microb Technol1999, 25 (8-9):718-724），小球诺卡氏菌Nocardia globerula（Sharma等，Process Biochem2006, 41 (9):2078-2081），以及红球菌Rhodococcus sp. NDB 1165（Prasad 等，World J Microbiol Biotechnol2007, 23 (3):345-353）产生的腈水解酶作为催化剂生物转化3-氰基吡啶制备得到烟酸。而进入21世纪以来，来自捷克的学者研究发现真菌腈水解酶在比酶活、选择性方面特征具有更明显的优势，表现出比细菌腈水解酶更大的催化潜力（Vejvoda等，Process Biochem 2010, 45 (7):1115-1120），他们以茄病镰刀菌Fusarium solani O1和黑曲霉菌Aspergillus niger K10为研究目标，将其应用于3-，4-氰基吡啶制备烟酸和异烟酸的生物转化中，取得了良好的效果（Martínková等，Biotechnol Adv 2009, 27 (6):661-670）。但是这两株菌所产生的真菌腈水解酶均存在微弱的腈水合酶活性，转化过程中在生成羧酸的同时会产生一定量的酰胺类化合物。而且研究表明这一副反应几乎存在于所有真菌腈水解酶的生物转化反应中。

定点突变技术近年来在酶的基因工程改造中应用日益广泛，在提高酶活性、改善酶的催化特征等方面取得了非常有益的效果。但是该技术在腈水解酶的改造中还应用较少，尤其对于真菌腈水解酶，鲜有定点突变改造的文献报道，而在国内，尚未见任何关于基因工程改造真菌腈水解酶的文献或专利报道。因此，定点突变改造真菌腈水解酶的研究具有极佳的理论和应用价值。

发明内容

本发明总的目的是通过定点突变的方法对真菌腈水解酶基因进行改造，使改造后的基因工程腈水解酶在酶活性方面有所提高，在酰胺生成能力方面有所减弱；进一步，使定点突变改造后的腈水解酶得到高效表达，最终能达到工业化生产的要求。

本发明的首要目的是对赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1（该菌株为赤霉菌（Gibberella intermedia）CA3-1，保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4903，保藏日期为2011年5月24日。）提供一种定点突变改造的基因工程腈水解酶，所述的基因工程腈水解酶具有更好的酶活性和更低的酰胺生成能力。

本发明提供了一种定点突变改造的基因工程腈水解酶，所述的基因工程腈水解酶的成熟蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No. 1，该成熟蛋白是由SEQ ID No. 2的核苷酸序列所编码的。

本发明所述的一种定点突变改造的基因工程腈水解酶，它是由氨基酸序列为SEQ ID No. 3的来源于赤霉菌的真菌腈水解酶中制造氨基酸取代而产生的，其特征在于所述的基因工程腈水解酶氨基酸序列相对于未突变的天然真菌腈水解酶氨基酸序列的第144位谷氨酸Glu突变为缺失。

本发明所述的氨基酸取代产生氨基酸序列为SEQ ID No. 3的真菌腈水解酶。

本发明同时提供了一种改善氨基酸序列为SEQ ID No. 1的基因工程腈水解酶的酶活性的方法，该方法是通过在SEQ ID No. 3的氨基酸序列第144位Glu敲除以改变来源于赤霉菌的天然真菌腈水解酶的氨基酸序列。

本发明同时提供了一种降低氨基酸序列为SEQ ID No. 1的基因工程腈水解酶的酰胺生成能力的方法，该方法是通过在SEQ ID No. 3的氨基酸序列第144位Glu敲除以改变来源于赤霉菌的天然真菌腈水解酶的氨基酸序列。

本发明还提供了一种DNA分子，其编码如前所述的基因工程腈水解酶。

本发明还提供了一种重组质粒，其含有如前所述的DNA分子。

本发明还提供了一种宿主细胞，其含有如前所述的DNA分子，或含有如前所述的重组质粒。

将定点突变获得的基因工程腈水解酶重组质粒转入大肠杆菌E. coli Rosetta-gami(DE3)宿主中，实现高效表达。

本发明所述的具有生物活性的基因工程腈水解酶可以通过IPTG诱导的方式大量产生获得。通过亲和层析方法，对定点突变的基因工程腈水解酶进行了分离纯化，得到了高活性的基因工程腈水解酶。结果表明，以3-氰基吡啶为底物，定点突变的基因工程腈水解酶较未突变的天然腈水解酶比酶活提高了80%以上，比酶活达到5.1 U/mg；酰胺生成量降低了30%，仅为1.75%。

本发明还提供了一种基因工程腈水解酶用于烟酸合成的方法，该方法包括：在适合的条件下收集如前所述的基因工具腈水解酶产生的宿主细胞，添加底物3-氰基吡啶在一定温度下进行生物转化反应。

本发明所提供的基因工程腈水解酶具有更高的催化活力和更低的酰胺生成能力，具备一定的工业应用潜力，为真菌腈水解酶在烟酸合成中的大规模、低成本应用奠定了基础。

本发明的优点和有益效果：

通过定点突变，对真菌腈水解酶的氨基酸序列第144位Glu进行了敲除，构建了一种基因工程腈水解酶，大大提高了真菌腈水解酶的催化活力，并且使真菌腈水解酶的酰胺生成能力显著降低，减少了转化过程中的酰胺生成量。目前，这是国内对真菌腈水解酶进行定点改造的首次研究报道。

 

具体实施方式

实施例1

本发明以赤霉菌来源的真菌腈水解酶基因序列为参考，设计并合成两条寡聚核苷酸引物，采用未突变的重组质粒，通过反向PCR的方法扩增突变质粒。

两条寡聚核苷酸引物如下：

Forward primer：TACGGTGACGGACAGGGCTCTCTGA

Reverse primer：ATTGGTCAGAGAGCCCTGTCCGTCAC

PCR反应体系为：

Pfu enzyme0.5 μL10×buffer5 μLTemplate DNA1 μLdd H₂O38.5 μLdNTP3 μLForward primer1 μLReverse primer1 μLTotal50 μL

PCR程序条件设定为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸8 min，35个循环；72℃终延伸60 min。

对扩增获得的PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，采用DNA胶回收试剂盒对目的片段进行割胶回收。

实施例2

    割胶回收获得的PCR产物采用Dpn I限制性内切酶进行酶切消化，酶切条件：37℃温浴0.5 h。酶切反应体系如下：

DpnI1 μL10×buffer2 μLDNA10 μLdd H₂O7 μLTotal20 μL

    消化产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，其余产物用于后续实验。

实施例3

取消化的PCR产物42℃热击90 s转化大肠杆菌E. coli DH5α感受态细胞，涂布于含Kan⁺抗性（10 mg/L）的固体LB平板上，37℃培养10~12 h。挑取单菌落，接入LB液体培养基培养，提取质粒，进行酶切及PCR验证。选择阳性克隆质粒送至上海生工测序。测序结果正确者42℃热击90 s转化大肠杆菌E. coli Rosetta-gami (DE3)感受态细胞，在含Kan⁺（10 mg/L）和氯霉素（35 mg/L）抗性的LB平板上37℃培养过夜，筛选阳性转化子，即为基因工程腈水解酶产生菌。

实施例4

将基因工程腈水解酶产生菌接入LB液体培养基中37℃培养12~16 h，获得种子液。将种子液转接至新鲜的LB培养基中37℃培养至OD₆₀₀达0.6~0.8，添加终浓度0.5 mM的IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）在25℃下进行产酶诱导4~24 h，即获得了游离催化剂。

采用超声破碎方法对游离进行超声破碎，制备获得无细胞抽提液，使用Ni-NTA琼脂糖凝胶柱纯化基因工程腈水解酶，采用咪唑进行洗脱，收集纯蛋白。测定纯蛋白的酶活性，腈水解酶酶活定义是指样品在3-氰基吡啶浓度为50 mM，反应介质为pH 7.2，100 mM的磷酸钠缓冲液，反应温度为30℃的条件下，每分钟从反应体系中释放1μmol氨，即为一个酶活单位，以U表示。

结果表明，定点突变的基因工程腈水解酶较未突变的天然腈水解酶比酶活提高了80%以上，比酶活达到5.1 U/mg；通过HPLC方法检测反应液中的酰胺含量，结果表明酰胺生成量降低了30%，仅为1.75%。

实施例5

将上述获得的发酵液8000 rpm离心10 min收集游离细胞，并采用磷酸钠缓冲液洗涤游离细胞，重悬在相同的缓冲液中制成菌悬液。将游离细胞的菌悬液稀释至一定浓度，在菌悬液中缓慢添加10 g/L的3-氰基吡啶，采用HPLC监测反应过程，结果表明，所有底物在8 min以内即能转化完全，在反应液中检测不到任何底物残留，在反应液中生成了约12 g/L的烟酸。

SEQ ID No. 1

Universal code

Total amino acid number: 319, MW=35811

Max ORF starts at AA pos 1(may be DNA pos 1) for 319 AA(957 bases), MW=35811

1         METSerLysThrLeuLysValAlaAlaIleGlnAlaGluProValTrpAsnAspLeuGln

21        GlyGlyValAsnLysSerIleGlyLeuIleGlnGluAlaAlaLysAsnGlyAlaAsnVal

41        IleGlyPheProGluValPheIleProGlyTyrProTrpSerIleTrpAlaAsnSerPro

61        ThrGluAsnAlaProTrpValAsnGluTyrPheLysAsnSerLeuGluArgGluSerPro

81        GluMETAspGlnIleArgAlaAlaValArgGluAlaGlyValPheValValLeuGlyTyr

101       SerGluArgTyrArgGlyThrLeuTyrIleAlaGlnSerPheIleAspGluThrGlyThr

121       IleValLeuHisArgArgLysIleLysProThrHisValGluArgAlaIleTyrGlyAsp

141       GlyGlnGlySerLeuThrAsnValAlaAspThrLysPheGlyArgValAlaGlyLeuAsn

161       CysTrpGluHisThrGlnThrLeuLeuArgTyrTyrGluTyrSerGlnAspValAspIle

181       HisValSerSerTrpProSerIlePheProGlnAsnValProGluTrpProTyrHisIle

201       ThrProGluCysCysLysAlaPheSerHisValValSerMETGluGlyAlaCysPheVal

221       LeuLeuAlaSerGlnIleMETThrGluGluAsnHisLysLysAlaAsnValGluGlyTyr

241       AspTyrThrLysLysSerGlyGlyGlyPheSerMETIlePheSerProPheGlyGluGlu

261       LeuValLysProLeuAlaProAsnGluGluGlyIleLeuTyrAlaAspIleAsnLeuGlu

281       GluLysTyrLysAlaLysGlnAsnLeuAspIleValGlyHisTyrSerArgProAspGln

301       LeuSerLeuArgValAsnLysHisAlaAlaLysProValPhePheAlaAsnAspLeu

 

SEQ ID No. 2

SEQ: 960 bp;

Composition  232 A; 272 C; 237 G; 219 T; 0 OTHER

Percentage:  24.2%  A; 28.3%  C; 24.7%  G; 22.8%  T; 0.0%OTHER

Molecular Weight (kDa): ssDNA: 295.77 dsDNA: 591.87

ORIGIN

1      ATGTCCAAGA CTCTCAAAGT CGCTGCCATC CAAGCCGAAC CCGTCTGGAA CGATCTCCAG

61     GGCGGTGTCA ACAAGTCCAT CGGTCTCATC CAAGAGGCAG CAAAGAACGG TGCCAACGTA

121    ATCGGCTTCC CTGAAGTCTT CATTCCTGGA TATCCATGGA GCATCTGGGC CAACTCGCCT

181    ACCGAGAACG CACCATGGGT CAATGAGTAC TTCAAGAACT CATTGGAGAG AGAGTCACCT

241    GAGATGGACC AGATCCGAGC TGCTGTTCGA GAGGCAGGCG TCTTTGTAGT CCTTGGATAT

301    AGTGAGAGAT ACAGGGGAAC TCTTTACATC GCACAGTCCT TCATCGATGA GACCGGCACT

361    ATTGTTCTCC ACCGCCGCAA GATCAAGCCC ACCCATGTTG AGCGTGCTAT CTACGGTGAC

421    GGACAGGGCT CTCTGACCAA TGTCGCCGAC ACGAAATTTG GCAGGGTTGC TGGTCTTAAC

481    TGCTGGGAGC ACACCCAGAC ACTTCTCCGC TACTATGAAT ACTCCCAGGA TGTCGATATC

541    CACGTCTCCA GCTGGCCTTC CATCTTCCCC CAGAACGTCC CTGAGTGGCC ATACCATATC

601    ACTCCCGAAT GCTGCAAGGC CTTTTCTCAC GTCGTCTCCA TGGAGGGAGC CTGCTTCGTT

661    CTTCTGGCAA GTCAGATCAT GACTGAGGAG AACCATAAGA AGGCGAACGT TGAAGGCTAC

721    GACTATACTA AGAAGTCTGG TGGCGGCTTC AGTATGATCT TCTCGCCTTT CGGAGAGGAG

781    CTTGTCAAGC CCCTTGCTCC TAACGAGGAG GGTATTCTTT ACGCTGATAT CAACCTTGAG

841    GAGAAGTACA AGGCGAAGCA GAACTTGGAC ATTGTCGGCC ACTACTCGCG ACCCGACCAG

901    CTGAGCCTTC GCGTCAACAA ACATGCTGCC AAGCCTGTCT TCTTTGCCAA CGACCTGTGA

 

SEQ ID No. 3

Universal code

Total amino acid number: 320, MW=35940

Max ORF starts at AA pos 1(may be DNA pos 1) for 320 AA(960 bases), MW=35940

1         METSerLysThrLeuLysValAlaAlaIleGlnAlaGluProValTrpAsnAspLeuGln

21        GlyGlyValAsnLysSerIleGlyLeuIleGlnGluAlaAlaLysAsnGlyAlaAsnVal

41        IleGlyPheProGluValPheIleProGlyTyrProTrpSerIleTrpAlaAsnSerPro

61        ThrGluAsnAlaProTrpValAsnGluTyrPheLysAsnSerLeuGluArgGluSerPro

81        GluMETAspGlnIleArgAlaAlaValArgGluAlaGlyValPheValValLeuGlyTyr

101       SerGluArgTyrArgGlyThrLeuTyrIleAlaGlnSerPheIleAspGluThrGlyThr

121       IleValLeuHisArgArgLysIleLysProThrHisValGluArgAlaIleTyrGlyAsp

141       GlyGlnGlyGluSerLeuThrAsnValAlaAspThrLysPheGlyArgValAlaGlyLeu

161       AsnCysTrpGluHisThrGlnThrLeuLeuArgTyrTyrGluTyrSerGlnAspValAsp

181       IleHisValSerSerTrpProSerIlePheProGlnAsnValProGluTrpProTyrHis

201       IleThrProGluCysCysLysAlaPheSerHisValValSerMETGluGlyAlaCysPhe

221       ValLeuLeuAlaSerGlnIleMETThrGluGluAsnHisLysLysAlaAsnValGluGly

241       TyrAspTyrThrLysLysSerGlyGlyGlyPheSerMETIlePheSerProPheGlyGlu

261       GluLeuValLysProLeuAlaProAsnGluGluGlyIleLeuTyrAlaAspIleAsnLeu

281       GluGluLysTyrLysAlaLysGlnAsnLeuAspIleValGlyHisTyrSerArgProAsp

301       GlnLeuSerLeuArgValAsnLysHisAlaAlaLysProValPhePheAlaAsnAspLeu