阿德福韦耐药HBV毒株定量检测方法的建立及其应用

摘要

目的：建立定量检测阿德福韦耐药HBV毒株含量的方法并用于临床分析。rn 方法：根据ADV耐药HBV rtA181和rtN236变异特征设计特异引物和Taqman探针，通过适时荧光定量PCR方法检测变异株的含量，并对32例ADV治疗过程中出现病毒学突破、病毒学反弹、不充分应答或部分应答患者进行ADV耐药HBV毒株定量检测和序列分析。rn 结果：1)准确性、特异性检测显示本试剂(rtA181试剂、rtN236试剂)对变异株质粒符合率100%；对野生株质粒符合率100%；2)灵敏度检测显示变异株和野生株质粒按1：1000混合时，a/b(HBV DNA定量值与rtA181变异株的定量值之比)或a/c(HBV DNA定量值与rtN236变异株的定量值之比)小于1000；未服用过ADV药物的临床病人血清的a/b或a/c大于5000；3)根据结果判定标准32例临床病例rtA181位点完全变异株或变异株占10%以上、变异株占10%以下、完全野生株或变异株含量低于检出极限分别为6例、14例和12例；rtN236位点完全变异株或变异株占10%以上、变异株占10%以下、完全野生株或变异株含量低于检出极限分别为1例、7例和24例。4)直接序列分析发现6例患者血清HBV存在rtA181变异，其中1例存在rtA181和rtN236双变异，其他26例未发现ADV耐药相关变异。4)测序发现rtA181变异位点患者1、5、6以野毒株为主，患者2、3、4以变异株为主；而定量分析患者1-6 a/b分别为：8.32、1.66、0.93、1.76、1.03、7.13；患者5rtN236T变异以野毒株为主，对应a/c为3.11。rn 结论：本文建立的方法能定量检测阿德福韦耐药HBV毒株含量，具有极好的准确性、特异性，混合株灵敏度初步定为1：1000，使用该方法可以更早发现ADV耐药变异。